乙型肝炎病毒感染标志物的检测现状和思考
摘要：慢性乙型肝炎的病程可从非活动性携带者到进展性慢性肝炎(CHB)、肝硬化、肝癌。我国现有慢性HBV感染者约9300万例，其中慢性乙肝患者约2000万，原发性肝癌是我国男性的第二大肿瘤相关死因。高发病率、高致死率的肝硬化及肝癌已经成为影响国民健康和生活质量的重要因素并成为社会有限医疗资源的沉重负担。本文重点从病毒抗原和核酸两方面阐述目前HBV感染标志物检测的临床应用现状及相关进展，并提出作为检验医师应重视HBV标志物的合理应用和诠释，积极参与临床诊治，为提高我国乙肝的临床诊治水平做出检验人的贡献。(中华检验医学杂志，2015，38：145–14作者：高春芳吴孟超全球慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者约4亿，亚太地区是全球HBV的高发区[1]。在我国临床各类(约103种)肝病中，病毒性肝病占一半以上；病毒性肝病中，乙型肝炎占80%以上。一般人群HBsAg携带率为7.18%。据此推算，我国现有的慢性HBV感染者约9 300万例，其中慢性乙型肝炎患者约2 000万例[2]。HBV感染时的年龄是影响慢性化的最主要因素。HBV是一种双链DNA病毒，病毒基因组松弛环状DNA(rcDNA)、共价闭合环状DNA(cccDNA)、前基因组RNA(pgRNA)是该病毒复制周期中重要的中间体，其中cccDNA的产生和存在是现有抗病毒手段难以根治乙肝的主要因素[3]。HBV感染标志物检测对于临床诊断、病程监测、疗效判断、预后分析等具有重要价值。目前临床常用的HBV感染标志物检测主要包括病毒抗原检测和核酸检测(含基因分型和突变)。这些标志物在临床的正确应用和解读是临床检验人主动参与临床乙型肝炎及其相关疾病诊治的关键。
一、HBsAgHBsAg是一分泌性包膜蛋白，与肝组织中cccDNA、总HBV–DNA相关[4,5]，而cccDNA是病毒复制的模板并维持HBV的慢性感染状态，因此HBsAg可作为肝细胞感染HBV的一个重要标志物。在CHB病程中，HBsAg在免疫耐受期含量最高，在免疫清除期开始下降，在HBeAg血清学转换后下降缓慢。最近已经进入临床应用的定量HBsAg检测对于临床预测长效干扰素治疗应答反应具有临床价值HBsAg在疗效监测中虽然不能替代HBV–DNA，但联合HBV–DNA可较早地预测疗效。血清中HBsAg的清除(seroclearance)是欧洲肝病学会(EASL)等慢性肝病防治指南中提出的理想治疗终点[6]，HBsAg被清除的CHB通常预后较好。值得注意的是尽管HBsAg携带者HBsAg自发性清除发生率约0.5%/年，抗病毒治疗的理想终点是HBsAg消失，但在HBsAg消失的个体中，有约一半以上者血清中仍可持续出现低水平HBVDNA。在HBsAg清除后数年的个体仍然会发生肝癌，这种情况特别见于年长或者在HBsAg清除前已经发生肝硬化的患者。目前已经进入临床应用的HBsAg定量检测敏感度在0.05 IU/ml，新的线性HBsAg检测定量系统，敏感性已达到0.005 IU/ml，2013年已经通过了日本FDA的批准[7]。采用敏感方法进行HBsAg等检测将有利于临床隐匿性肝炎的诊断、献血源筛选以及原发性肝癌发病监测。
二、病毒核心蛋白HBeAg与HBcAgHBeAg是HBV基因组中C区基因编码的非结构性分泌蛋白，研究表明HBeAg是否发生血清学转换与患者的年龄、ALT水平和HBV基因型有关[8]。越早发生HBeAg转换或者HBeAg阳性期越短，治疗缓解的几率越高。当然临床上还应重视前C区G1896A变异，临床判断是否出现血清学转换或判断HBV携带者时应关注这种变异。在抗病毒治疗的适应证掌握上，e抗原是否阳性，具有不同的治疗策略[2,6,8,9]。HBeAg阴性CHB治疗后复发率高。因此最好选择干扰素类或耐药发生率低的核苷(酸)类抗病毒药物治疗。目前已有商业化HBeAg定量检测系统，研究表明，在长效干扰素PegIFNα–2a的治疗过程中，定量监测HBeAg水平对治疗应答有较好地预测价值。HBcAg则是HBV病毒衣壳的结构蛋白，来自于pgRNA。由于HBeAg和HBcAg具有149氨基酸序列相同的片段，因此有文献将两者统称为HBV核心相关抗原(HBcrAg)，已采用全自动化学发光检测[10]。研究表明HBcrAg的检测可以作为有创性肝组织cccDNA检测的替代检查，用于预测治疗后的复发及监测CHB病程。与丙型肝炎病毒核心抗原的检测类似，HBcrAg检测需要前处理将HBcAg从病毒中释放，同时也能解聚抗原抗体复合物，从而提高检测效率。目前国内临床尚没有常规开展HBcrAg的检测，该指标较现有标志物的可能优势，特别是与肝内cccDNA检测的相关性及其动态应用价值尚有待进一步评价。
三、HBV核酸定量、基因分型及突变检测HBV DNA定量检测是临床判断病毒复制水平的直观指标，也是判断疗效的有价值指标，与HBsAg定量检测联合应用对于预测抗病毒疗效具有一定临床意义。近年CFDA已经明确规定新申请注册的HBV DNA检测试剂的分析灵明度应不低于30 IU/ml，较既往500 IU/ml的标准有了显著提高。目前国内HBV DNA定量检测基本以使用国产试剂为主，但30～100 IU/ml的临床检测性能，部分国产试剂的重复性、准确性尚有待提高。HBV基因分型及其多耐药位点分析，是临床实现个体化用药及疾病转归预测、制定个体化随访方案的重要依据。最新报告提示HBV至少具有10种基因型，我国以C性和B型为主。HBV耐药包括了基因型耐药、表型耐药、交叉耐药。依据这三种耐药的定义，目前进入临床检测的属于基因型耐药和交叉耐药。EASL指南提供的交叉耐药信息主要包括了拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦、阿德福韦和替诺福韦五个药物[6]。在耐药突变检测的临床应用中，笔者实验室对现有的几种已得到CFDA批准的方法(膜芯片、硅芯片、测序)进行了比对，非常遗憾结果一致性较差。一代测序作为"金"标准，具有结果可靠、除特定耐药位点外，可以发现未知突变等优点，但敏感性不足，通量低，且操作繁琐：需要两次PCR、两次PCR产物纯化、PCR产物凝胶电泳定量等，对设备、操作者以及防污染等要求较高，耗时长(1.5 d)；芯片杂交法虽敏感性有所提高，但待测位点的覆盖、特异性、准确性等均有待提高。在多区突变检测中，本实验室前期采用一代测序及二代测序法(NGS)对HBV相关原发性肝癌患者肝脏组织HBV全基因组研究，发现了一些高频、不同于文献报道的已知突变。此外，文献及本实验室研究均发现部分位点的变异对现有乙肝标志物检测结果存在影响，例如：C3116T、C1653T突变与HBeAg、C3116T突变与HBV–DNA载量、Pres/S区突变/缺失与HBsAg等[5,11]。了解、掌握这些新进展，对于有效临床沟通，提升临床检验服务内涵具有重要意义。二代测序运用于突变检测具有较一代测序更大的优势，特别在低丰度变异以及突变频率、分析通量及病毒复杂度计算等方面[12]。HBV基因变异除了目前临床作为基因型/亚型分型以及抗病毒药物耐药位点分析的依据外，还可以用作HBV相关肝病病理转归(如肝硬化、肝癌)的预测或辅助早期诊断[13]。最新研究在HBsAg/HBsAb双阳性患者的HBsAg主要亲水区中发现了多个突变位点导致的氨基酸替换(aa 113，114，116，123，129，130，131)，新糖基化位点，使HBsAg与HBsAb的结合减弱，且突变后的病毒包膜形成及病毒分泌能力更强[14]。且这一突变可以在人群中横向传播，可导致疫苗保护失败或者慢性感染患者的重复感染。HBV基因的这些突变对未来乙型肝炎防控提出了更大挑战。目前有关HBV基因研究的另一个热点是病毒基因整合至宿主基因的研究，NGS技术的出现和发展为该研究提供了强大的技术支撑。HBx–人基因嵌合转录本及嵌合蛋白可能与肝癌的发生发展有关[15,16]。因此这些整合后的嵌合基因及其产物检测的临床意义和未来应用值得探索。
四、问题和思考基于临床检验诊断学特征，综合四大临床指南(中国、亚太、欧洲、美国)，结合国内国情和目前相关研究进展，目前与CHB及其相关疾病临床管理中乙肝感染标志物检测相关的主要问题建议关注以下问题。临床应用上，HBsAg、HBeAg的定量检测在临床制定治疗策略及其疗效监测中的作用有多大？HBV基因分型是否应该作为检测常规纳入基于干扰素等抗病毒治疗的常规检测方案中？基因分型是否需要细化至亚型及其临床管理应用价值？此外，新的交叉耐药位点的认识和发现、多种HBV热点突变对于预测或辅助诊断肝癌、肝硬化以及疾病进展的作用、HBV–人基因嵌合体检测的临床意义等均需要进一步扩大验证和评价。检测技术上，国产HBV核酸定量检测低浓度区(<100 IU/ml)的稳定性和准确性亟待提高；现有的HBV基因突变特别是耐药位点检测方法学的敏感性、准确性及流程可操作性尚难以满足临床应用，亟待进一步优化；NGS技术用于HBV基因突变及其频率分析中的质量控制、测序后数据分析、临床应用等，有待在应用中不断完善。我国是一个肝病大国，乙肝发病人群基数大，不同地区医疗水平差异大，如何将有限的医疗资源最大化现实意义重大。我国作为乙型肝炎的重灾区，国家在十一五、十二五都给予了较大的投入，但在关键检测技术的自主研发、转化上仍与欧洲一些发达国家以及美国、日本存在较大差距。如何缩短差距、加快研究转化和国产化，我们检验人任重而道远。
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