HPV基因检测技术新进展
作者：温旺荣，李莉单位：暨南大学附属第一医院临床医学检验中心
自从Zur Hausen教授在1977年发现人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌发生的一个重要原因以来，相关研究不断深入，99.7%宫颈癌患者存在HPV感染，目前已经证实HPV感染是宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)和宫颈癌的主要病因。
不同地区HPV的人群感染率不同，所携带的型别也可不同，而且不同HPV基因型别的感染分布、致病性及其后果存在差异。迄今发现的HPV感染至少有200种基因型(也称亚型)，其中有40多种与生殖道感染有关，根据HPV致宫颈癌的风险性不同，分为高危型HPV和低危型HPV两大类。至少有18种HPV与宫颈癌发生有关，称为高危型HPV，其基因整合到宿主细胞染色体中称为整合形式致病，由底层向中表层侵犯鳞状上皮细胞，通过HPV E6与P53蛋白，HPV E7蛋白与pRb相互作用，干扰宿主细胞生长引起癌变，与CINⅢ、宫颈癌和其他部位癌变如头颈癌有关。高危型HPV的存在预示着疾病的存在。而低危型HPV DNA位于宿主染色体之外，呈现游离状态即游离基因，仅侵犯鳞状上皮底层细胞，呈低度复制状态，存在于各种良性的皮肤或黏膜疣中，也存在于CINⅠ中。因此，HPV基因分型检测是处理宫颈病变的重要依据，也是宫颈癌筛查中不可缺少的内容。该检测方法发展较快，有些方法已在临床广泛应用。
一、HPV基因检测技术
HPV基因检测技术是通过检测临床标本中HPV DNA或其表达产物mRNA等来实现的，根据采用的原理不同，可分为基于分子杂交的方法、基于荧光定量聚合酶链反应技术(fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ–PCR)的方法、基于PCR＋后续分析的方法、酶切信号放大法及mRNA检测法等5大类。
(一)基于分子杂交的方法
应用分子杂交的原理设计的方法主要有斑点印迹法、Southern印迹法、原位杂交法和杂交捕获法。临床上常用的方法是杂交捕获法即第二代杂交捕获法(hybird captureⅡ，HCⅡ)，是我国应用最早并且较普遍的检测HPV DNA的方法，于2003年通过美国FDA认证。它是利用一种基于液相的HPV DNA–RNA探针杂交及非同位素信号放大系统的方法。HCⅡ能同时检测13种高危基因型和5种低危基因型，具有较高的敏感度和特异度，不要求很高的实验室条件，基层医院可以推广，多用于初筛，可以作为目前其他新方法的对照标准。但这种方法也存在一定的缺陷，只能笼统的将患者分为高危型感染或低危型感染，但不能区分具体哪型感染，也不能判断多重感染，并且探针间存在一定的交叉杂交反应。
(二)基于FQ–PCR的方法
FQ–PCR法采用针对某个HPV基因型的特异引物及探针扩增病毒DNA序列。这种方法敏感度和特异度高，可以进行病毒载量测定，也可以明确HPV的具体型别，不需要后续分析，但单通道检测每个反应只能检测1个HPV型别，如需检测多个型别则要在不同的反应体系中进行。肖克林等报道过一种多重实时PCR法，能同时检测13种高危型HPV，但不能具体分型。可见要实时定量检测到每一种亚型，需要更多的试剂和更复杂的操作工序。cobas4800 HPV检测也是采用FQ–PCR法，能同时检测14种高危型HPV，有针对HPV16、18、内参β–微球蛋白及其他12种HPV类型的4种探针，因此能特异分析HPV16及18的病毒载量，其他12种则不能具体分型，该检测系统已于2014年通过美国FDA认证。BD HPV test检测系统亦是基于FQ–PCR法。近年来，也有不少研究提示血液循环HPV DNA阳性的宫颈癌患者往往临床预后较差，易产生复发和远处转移，因此，已有建议宫颈癌治疗后HPV阳性的患者进行血液HPV DNA检测，对判定有无宫颈癌血液转移具有一定的参考价值，能早期发现复发或转移。
(三)基于PCR加后续分析的方法
这种方法需要先进行通用引物PCR，因为通用引物一般设计在HPV序列中较为保守的位置，所以可以扩增广谱的HPV亚型，对扩增产物进行后续分析即可确定HPV的基因型别，可以同时检测多种基因型。常用的方法有下面4种。
1．导流杂交法：
导流杂交法是目前临床上应用较多的一种HPV检测方法，主要原理是用标记了生物素的通用引物扩增后的产物用导流方式穿过预先固定有相应探针的纤维薄膜，发生快速杂交，再通过酶标显色后用肉眼判断感染的型别。可同时检测21种HPV基因型，分别为13种高危型，5种低危型和3种中国人群常见类型。这种方法结合了PCR、核酸快速导流杂交和酶联显色技术，可以检测具体感染的型别，还可以判断双重和多重感染，弥补了HCⅡ的不足。我们进行过该法与HCⅡ方法的比较研究，发现该法的敏感度和特异度与HCⅡ有较高的一致性，检测时间短，通量较大，一次检测型别多，不需要昂贵仪器，可在基层医院使用，是目前HPV基因筛查的一个较为实用的方法。其缺点是不能进行病毒载量测定。
2．流式荧光杂交法：
也称为液相芯片技术或(微球)悬浮阵列技术，整个反应过程都在混悬于液相中的微球表面上进行，能够同时检测13种HPV基因型，通量大，无需洗涤，速度较固相杂交快，灵敏度和特异性也比较好，临床有一定应用，但存在一定的交叉污染，可能出现假阳性，且需要较贵的设备检测荧光信号，不易在基层医院使用。
3．基因芯片法：
基因芯片法具有微型化、自动化、高度并行性和多样化的优点，将基因芯片法用于HPV基因的检测，可同时区分同一标本中的多种基因型，并判断多重感染。如Linear Array HPV基因分析系统就是基因芯片法，能检测18种高危和19种低危HPV型别，敏感度高，交叉反应少。
4．基因测序法：
基因测序法可对每种已知序列的HPV基因型进行分型，理论上可以检测出所有的HPV型别，可以检测依靠一般探针不能检测的少见型别或者新发现的型别，灵敏度高，特异性好，通常作为其他方法的金标准。但这种方法需要配备较贵的基因测序仪，费用高，对多重感染需分次检测，操作耗时，多数只用于一些确认试验或科研中。
(四)酶切信号放大法
以Cervista高危HPV检测系统为代表，能检测14种高危HPV，它是基于Cleavase酶促反应的原理，通过两步反应，即识别目标DNA及产生可检测的荧光信号，最终进行荧光阅读得到结果，特异性高，无需进行PCR扩增，已通过FDA认证。
(五)mRNA检测法
最近临床已在检测HPV致癌基因表达水平，即基于HPV DNA的转录产物mRNA进行的检测。目前常见的是针对HPV的癌基因E6及E7的转录产物mRNA进行检测，目前有PreTect HPV–Proofer及APTIMA系统等，后者通过FDA认证。结果阳性反映的是病毒持续感染后出现整合感染，并处于活动期，提示有恶性转变风险。据报道，宫颈疾病中mRNA比DNA更具特异性，其表达率更能准确反映患宫颈癌的风险。
二、HPV基因检测技术在临床中的应用
(一)早期诊断和早期预防
HPV基因检测能够在细胞学出现异常前发现感染，对那些细胞学无异常而HPV16、18阳性感染者，应立即进行阴道镜检查以观察是否有宫颈病变；对于HPV感染患者不仅要重视其是否已经导致宫颈病变，积极进行临床治疗，还要重视其所感染的具体型别，特别是高危型HPV16感染者应密切随访，以便及早发现异常和及早干预，有效降低宫颈癌的发生。
(二)与细胞学检查的联合应用
细胞学检查存在一定的假阴性率，HPV基因检测技术联合细胞学检查可以有效减少漏诊。并且对难以定性的不典型鳞状上皮细胞和低级别宫颈脱落细胞巴氏细胞涂片结果可作进一步分类并作判断。
(三)治疗后监测
对高级别宫颈上皮内瘤变和微小浸润癌进行锥切治疗后的监测，可以预测复发的风险。
(四)流行病学调查
进行流行病学调查，可以检测不同地区流行的主要HPV型别，不断补充我国HPV疫苗研究所需要的各地区型别分布数据，并进一步指导研发我国预防性宫颈癌疫苗。
三、展望
基因检测技术给病毒及病毒与肿瘤之间关系的研究带来了进展。这些检测技术应用在HPV的研究上，发现了高危型HPV的持续感染是宫颈癌的病因。此外，高危型HPV疫苗的出现也得益于这些研究。而现在HPV疫苗在我国大陆地区已处于临床试验阶段，不过我国还缺乏系统、全面、科学的HPV型别地区分布数据，未来将加以完善并在宫颈癌的预防方面发挥重大的作用。
评估高危型HPV持续感染，不仅需要甄别HPV基因型别，同时也需要检测该HPV基因型别的病毒载量、HPV病毒基因组在宿主染色体的整合状态等，因此临床HPV基因检测将发展上述3个方面同时检测，只是目前同时考虑3个方面的研究仍然较少，应提倡全面评估高危型HPV持续感染。
病毒载量测定的影响因素及结果解析值得探讨。首先病毒载量与采集的部位、采集的脱落细胞的数量、采集方法、运送标本等方面密不可分，必须严格规范化、标准化条件，解决组织细胞损失及提取过程中DNA丢失的问题，毕竟不像血清容易定量，实验过程中同时也要设定内参。其次，病毒载量的测定曾被认为是预测宫颈癌前病变及宫颈癌进展的有效手段，然而最近研究表明，至少单纯的病毒载量测定经常会误导宫颈癌进展的预测。第三，HPVE6和E7致癌基因高表达时，病毒复制受到负调控，因此，作为监视病毒复制有效手段的病毒载量测定对于预测持续感染依然存在一些缺陷，应该综合分析。
HPV E6和E7癌基因的表达是维持持续感染的关键，对这两个癌基因mRNA的检测能反映病毒持续感染后的整合状态，对宫颈疾病的恶性转变有提示作用，日益受到重视。
随着分子诊断技术的不断发展，HPV基因检测方法将会不断完善，即未来需要一种更易普及、成本较低、操作简便、能同时检测病毒基因型别、病毒载量和病毒基因整合状态的方法，以便能真正评估高危型HPV的持续感染情况。此外，一些新分子标志物如miR–155、miR–21可能作为宫颈癌的早期诊断、复发的预后指标，值得进一步研究推广。
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来源：中华检验医学杂志
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