疫苗澄清技术专题2
疫苗澄清技术专题（二）：病毒疫苗澄清策略及表达系统影响2016-11-09 仕必纯 生物咖啡茶许多疫苗含有完整或部分病毒颗粒，以获得针对病毒感染的免疫源性，病毒疫苗通常可分为4种类型：
➀ 活性衰减病毒疫苗，基于经弱化并降低毒力的病毒株。衰减病毒可在体内复制，但不具有致病性。
➁ 灭活病毒疫苗，含有经化学或UV灭活，以去除感染性的病毒，可以是完整的病毒或只含有抗原蛋白。
➂ 病毒载体疫苗，可表达感染性病毒抗原的活性、非感染性病毒，其亦可用于基因治疗。
➃ 病毒样颗粒（VLP）疫苗，其为特定类型的病毒亚单位疫苗，可模拟除感染性基因材料外的病毒颗粒整体结构。
http://mmbiz.qpic.cn/mmbiz/c63FLjORCZP6TM8NYbgpAjmm0gicOjyWkrCpoYZ5NWP3tOxr1af0HJ3Moibu21TLeCOFRd1kWH3icxIn05k4AZ54Q/640?wx_fmt=png 在多数情况下，病毒颗粒在澄清步骤中保持完整，即使是裂解病毒疫苗工艺，因裂解通常在纯度更高的下游环境中进行。病毒澄清的主要挑战是收获高产量的病毒颗粒，同时有效去除细胞碎片、较大的聚集物和不溶性杂质。
✦ 病毒疫苗澄清策略 病毒疫苗在尺寸、结构、形状和表达系统方面都存在较大的差异。所以，其下游工艺不存在通用的模板，特别是澄清步骤。理论上讲，所有可用的技术都可以选择，也可以结合起来使用，包括低速离心、TFF和DFF。而澄清成功与否，很大程度上受表达系统和目标病毒理化特性的影响。 近来，高密度细胞培养工艺开始用于病毒疫苗工艺，这对澄清操作提出了额外的挑战。在某些情况下，可使用增加预处理的方法来解决，如聚合物诱导絮凝、沉淀等，预处理可显著提高后续过滤器的处理量。
http://mmbiz.qpic.cn/mmbiz/c63FLjORCZP6TM8NYbgpAjmm0gicOjyWkCaGLr9Z1niaTw6N6ia1mtmEl2hGYyD1bIeQibZBKeDNnoaA2jDZrIQdMQ/640?wx_fmt=jpeg ✦ 表达系统的影响
澄清方法的选择很大程度上取决于上游工艺和表达系统的类型，因其决定了需去除的污染物的类型和含量。病毒疫苗常使用鸡胚、哺乳动物或禽连续细胞系生产，也可使用相对复杂的杆状病毒/昆虫细胞表达系统生产。
◢ 鸡胚生产的病毒 使用鸡胚生产病毒已经较长的历史，30年代，就已成功使用母鸡受精卵的绒毛-尿囊膜为底物生产病毒。现在，很多人用和兽用疫苗仍然使用这种传统的工艺，如季节性流感疫苗。鸡胚生产过程的原理是将目的病毒孵育于鸡胚，病毒可在绒毛尿囊膜上复制。增殖后，收集并纯化富含病毒颗粒的尿囊液。
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尿囊液是较难澄清的料液，因含有较多的矿物质和蛋白，导致粘度较高。尿囊液还可能还同时含有鸡胚来源的未发育的组织混合物，如羽毛、喙、血管或血细胞。因其固含量较高，可使用低速离心进行初步澄清，回收率一般在70%左右。也可使用过滤技术进行初步澄清。如聚丙烯和纤维素深层滤器的尿囊液收获能力可达到150-210L/m^2，进样料液浊度降低3倍。此外，开放进样流道的TFF设备也适用于尿囊液的澄清，此类设备可使进样流道两端的压力损失最小，降低堵塞。 二级澄清可使用DFF，聚丙烯、纤维素和玻璃纤维材质的过滤器即可达到很好的处理效率。另一种方法是使用0.65或0.45μm的TFF微滤设备，同时配合滤液流速控制。
◢ 哺乳动物和禽连续细胞系生产的病毒 近年来，多种疫苗的生产已经用基于细胞培养的工艺替换了鸡胚生产，特别是流感疫苗，包括使用哺乳动物或禽连续细胞系，如传统的Vero、MDCK及HEK293细胞系和专利的PER.C6和EB66细胞系。由于表达系统的不同，病毒可能产于胞内，后续需要细胞裂解，也可通过细胞溶解或出芽产于胞外。
http://mmbiz.qpic.cn/mmbiz/c63FLjORCZP6TM8NYbgpAjmm0gicOjyWk29ldaTb7adM0P4z6SIl2hqT1ict0DZpflXKDvehdu91B0xGozUdKC3w/640?wx_fmt=jpeg 从固含量和可溶性成分角度考虑，细胞培养收获液比尿囊液更加“干净”。所以，即使使用简单的DFF技术，也可获得较好的处理效果。但过滤器的处理能力也很大程度上取决于细胞培养条件，如收获液中的细胞密度及活性。这些参数会影响细胞碎片及聚集物的含量，此二者会造成堵塞，降低滤器处理能力。
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