北京协和医学院崔胜团队解析EV71 2C解旋酶高分辨率晶体结构
北京协和医学院崔胜研究员团队Science Advances成功解析EV71病毒2C解旋酶的高分辨率晶体结构近日，中国医学科学院 北京协和医学院 病原生物研究所崔胜研究员团队解析了2.5埃分辨率的EV71病毒2C解旋酶晶体结构（EV71 2C）。他们发现，2C 包含了ATP酶结构域，锌指结构及C端alpha螺旋区。2C解旋酶通过C端alpha螺旋与另一个2C分子表面疏水性口袋结合，发生多聚；他们证明，2C的多聚化是其酶活性和EV71病毒复制的前提条件，阻断2C多聚化是潜在的抗病毒策略。EV71 2C的晶体结构不但是微小核糖核酸病毒科的首个2C解旋酶高分辨率结构，而且是AAA+蛋白家族首个RNA解旋酶结构。这些发现为理解2C解旋酶机制提供了三维结构信息，为抗病毒药物设计提供了新思路。相关研究成果4月28日在线发表于Science子刊Science Advances，标题为“Crystal Structure of 2C Helicase from Enterovirus 71”。图1. EV71 2C晶体结构及其锌指结构微小核糖核酸病毒科既包括了危害人类健康的脊髓灰质炎病毒，手足口病病毒（EV71等），鼻病毒和甲肝病毒等；又包括了危害畜牧业的口蹄疫病毒。国家卫生计生委公布的数据显示：2015年我国手足口病新发病例已接近200万，位居丙类传染病之首。虽然EV71疫苗已上市，但其对引起手足口病的其他病毒（如CA16等）保护作用有限。脊髓灰质炎病毒疫苗已使用了数十年，仍不能完成世卫组织发起的“脊灰根除计划”的目标。由此可见，仅依靠疫苗难以实现疾病控制的目标，抗病毒药是必要的补充。然而，迄今为止，尚无抗微小核糖核酸病毒的药物上市。2C蛋白是微小核糖核酸病毒中最保守的复制酶之一，属于AAA+家族RNA解旋酶，参与了病毒脱衣壳、RNA合成和衣壳组装成等关键过程，因此是重要的药物靶标。由于2C蛋白极不稳定，国际相关领域历经数十年努力仍无法解析2C的高分辨率结构，阻碍了对其功能的理解及药物研发。崔胜课题组通过
图2. EV71 2C六聚体模型系统的构建优化，成功表达了截短N端膜结合区的2C蛋白并解析了晶体结构（2.5埃）。他们发现，2C含有一个ATP酶结构域，一个“双三棱锥”构型锌指和一个C端两亲性螺旋（图一）。ATP酶和锌指之间形成疏水口袋与另一个2C分子C端alpha螺旋结合，介导了2C自我多聚化。利用X射线小角散射等技术，他们发现2C的ATP酶活性严格依赖溶液中2C多聚体的形成，提示了多聚体是具有生物学活性得组装模式。为验证结构学的发现及推论，他们进而利用反向遗传学体系在细胞模型上逐一验证了2C的关键氨基酸突变对EV71复制的影响，他们证实C端螺旋介导的2C多聚化EV71毒进行复制的必要条件。由于六聚体组装是AAA+蛋白家族的特征之一，研究人员利用JCV的Large T antigen 六聚体结构为模板构建了EV71 2C六聚体模型 （图2），并推测了2C-RNA相互作用模式和2C成熟化剪切的机制（图3）。
图3. EV71 2C成熟化剪切机制示意图EV71 2C解旋酶结构的解析填补了微小核糖核酸病毒结构生物学研究领域的一个重要空白。目前，已发现数十种具有抗病毒活性的抑制剂靶向2C解旋酶。EV71 2C晶体结构的解析为揭示抑制剂作用机制、开展虚拟药物筛选和结构辅助的分子设计提供准确的三维信息；所建立的2C活性评价实验体系为抑制剂的筛选提供了关键技术平台。中国医学科学院 北京协和医学院 病原生物学研究所关洪鑫（博士生）为本文第一作者；中国医学科学院 北京协和医学院 病原生物学研究所崔胜研究员为本文通讯作者。该项研究得到了国家自然科学基金和国家重点研究和发展计划的资助。原文链接http://advances.sciencemag.org/content/3/4/e1602573Crystal structure of 2C helicase from enterovirus 71Hongxin Guan, Juan Tian, Bo Qin, Justyna Aleksandra Wojdyla, Bei Wang, Zhendong Zhao, Meitian Wang, Sheng Cui*Enterovirus 71 (EV71) is the major pathogen responsible for outbreaks of hand, foot, and mouth disease. EV71 nonstructural protein 2C participates in many critical events throughout the virus life cycle; however, its precise role is not fully understood. Lack of a high-resolution structure made it difficult to elucidate 2C activity and prevented inhibitor development. We report the 2.5 Å–resolution crystal structure of the soluble part of EV71 2C, containing an adenosine triphosphatase (ATPase) domain, a cysteine-rich zinc finger with an unusual fold and a carboxyl-terminal helical domain. Unlike other AAA+ ATPases, EV71 2C undergoes a carboxyl terminus–mediated self-oligomerization, which is dependent on a specific interaction between the carboxyl-terminal helix of one monomer and a deep pocket formed between the ATPase and the zinc finger domains of the neighboring monomer. The carboxyl terminus–mediated self-oligomerization is fundamental to 2C ATPase activity and EV71 replication. Our findings suggest a strategy for inhibition of enterovirus replication by disruption of the self-oligomerization interface of 2C.
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