基于 NGS 平台的丙型肝炎病毒基因分型及耐药检测
http://cache1.bioon.com/webeditor/uploadfile/201705/20170516183917803.png日前，英属哥伦比亚大学（以下简称英属哥大）卓越教学中心的研究人员开发了一种基于高通量测序的丙型肝炎病毒检测方法，该方法可鉴定产生耐药的病毒变种。研究人员表示，该检测方法还可进行病毒分型，是 PCR、杂交和基于 Sanger 平台检测技术的有力补充。与传统检测方法，基于 NGS 的检测方法具有更佳的检测范围及碱基分辨率。
据英属哥伦比亚大学艾滋病毒卓越教学中心的负责人安妮塔·豪尔介绍，目前，加拿大的患者均可免费进行该检测，但豪尔表示，她希望加拿大卫生机构最终能够覆盖该检测，她估计检测约需 270 美元。研究团队正在努力组建相关的国际联盟，并建立丙型肝炎病毒耐药变种数据库，以针对耐药菌株的增加采取对策。
丙型肝炎的独特之处在于 90%至 95%的长期感染者实际上是可以治愈的。然而，治疗药物比较昂贵，三个月的疗程的费用高达 30000~50000 美元。因此，对患者采用适宜的药物鸡尾酒疗法至关重要。
此外，一些患者感染了天然耐药的病毒株，如果在开始治疗之前不知道这些基因信息，那么这些患者的治疗将会以失败告终，患者将继续携带病毒，有着较高扩散耐药丙肝病毒的风险。豪尔强调，通过实施耐药检测，不仅有希望将治愈率提高，还将阻止丙型肝炎耐药株的传播。
基于此。英属哥大艾滋病毒卓越教学中心的研究人员开发了基因分型和耐药检测，对 104 碱基组成的丙型肝炎病毒基因组进行完整测序。该检测在 Illumina MiSeq 平台上进行，此前研究人员已经用 Sanger 测序检测对特异性耐药突变的两个患者队列进行了验证。通过检测一个包含 70 位患者的队列的特异性耐药突变，发现了一个针对药物 Olysio（辛伐他汀）耐药性的突变。此外，该团队还进一步在 90 位采用蛋白酶和 NS5A 抑制剂鸡尾酒疗法的患者体内检测到存在 NS3/4A、NS5A 和 NS5B 基因耐药突变，进一步验证了 NGS 检测的准确率。
检测能够同时鉴定丙型肝炎病毒基因分型。豪尔说，有七种不同的丙肝病毒基因型，大多数丙肝药物都是基因型特异的。她表示：“如果你对错误的基因型使用错误的药物，治疗失败的可能性就会很大。”
丙型肝炎病毒基因分型的标准方法是基于实时 PCR 方法。基因分型检测通常仅分析 104 对碱基丙型肝炎病毒基因组的约 100 个碱基对。但是，由于丙型肝炎病毒的突变率如此之高，因此有时检测会鉴定为不正确的基因型，或者无法鉴定基因型中的特定亚型。豪尔介绍，对整个丙型肝炎病毒基因组进行测序可以改善基因分型。
对一位病人的传统诊断检查流程是，医生首先进行基因分型检测，然后根据分型信息进行耐药检测——只寻找与特定基因型相关的耐药突变。所以如果基因分型检测是错误的，那么基于 Sanger 检测方法的耐药检测也将失败，豪尔说。但是，通过对整个丙型肝炎病毒基因组测序，可同时收集基因分型和耐药信息。
耐药检测也很重要，因为有证据表明对存在耐药突变的患者优化治疗策略可以增加治疗成功的可能性。例如，对于某些耐药突变，治疗周期只需要增加到 12 周以上。她说：“延长治疗周期有助于清除病毒的残余部分。”
对于其他类型的耐药突变，有证据表明，将药物利巴韦林加入鸡尾酒疗法有增加治疗效果的可能性。豪尔说添加利巴韦林的作用原理还不完全清楚，但是一个假说是利巴韦林有助于增强免疫系统。
对完整的丙型肝炎病毒基因组进行测序的另一个优点是，除了鉴定已知的耐药突变外，同时也能够鉴定潜在的新型耐药突变。因此，研究人员也在努力开展国际合作来收集和共享数据。豪尔说，英属哥大网站将作为构建数据库的中枢，目前正在努力搭建 IT 基础设施，并确定数据分享和隐私协议等技术细节。数据库将能够支持 NGS 测序数据以及 Sanger 测序数据。此外，豪尔还表示，研究团队希望将相关知识，检测标准流程和解读资源输出到其他国家，尽管她尚未制定具体的计划。
豪尔介绍，目前在丙型肝炎病毒药物仍高度有效时实施这样一个方案，对确保药物继续以极高的比例治愈病人至关重要。5%~10%未被治愈的患者“将携带耐药丙型肝炎病毒并继续传播病毒，只是这次是耐药丙型肝炎病毒，而非野生型病毒，耐药病毒感染的人数将随着时间的推移而继续扩大” 。
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