美学者发现恒河猴感染埃博拉病毒后可出现无症状持续感染现象并揭示其病理特征
导语2013年~2016年在西非暴发的埃博拉疫情，其空前的规模和传播范围引起了国际组织的高度关注。据统计，该次疫情至少已造成28646例感染病例，11323例死亡。虽然该次疫情已经宣告结束，但是，感染埃博拉病毒的康复病人仍可传播病毒并导致新的感染，因此埃博拉病毒引发的持续性感染及其长期影响（如失明、头痛和关节痛）一直是公共卫生关注的重点。此前由于缺乏合适的动物模型，研究EBOV如何在免疫系统中传播并持续存在几乎难以实现.然而，此前由于缺乏合适的动物模型，研究EBOV如何在免疫系统中传播并持续存在几乎难以实现。
2017年7月17日，自然子刊《Nature Microbiology》在线发表了美国马里兰州陆军传染病医学研究所研究组的一篇题为Identification and pathological characterization of persistent asymptomatic Ebola virus infectionin rhesus monkeys的研究论文。文章首次报道了恒河猴感染埃博拉病毒后可出现持续无症状现象并揭示其病理特征。EBOV可沿着血管结构突破血脑屏障到达眼睛，大脑和睾丸，与在人类中观察到的现象类似。并且证实了CD68+细胞（单核巨噬细胞）是EBOV的贮存细胞。
主要结果：
1、EBOV感染后无染症状恒河猴的眼睛、大脑及睾丸中检测到病毒RNA；病毒可沿着血管进入上述部位（图1）
首先，研究者对112只感染埃博拉病毒43天后的恒河猴的眼睛、大脑、淋巴组织、脾脏和肾脏等组织使用EBOV NP特异性探针进行原位杂交发检测。结果发现，虽然没有埃博拉感染的症状出现，112只恒河猴中仍有11只（9.82%）可在眼睛, 睾丸或脑组织检测到EBOV的基因组RNA。与此相比，常见的急性EBOV感染的靶器官(肝、淋巴结和脾脏)等却未检测到EBOV 基因组RNA。类似的结果也在EBOV另一种常用动物模型食蟹猴中观察到，对48只感染EBOV的食蟹猴幸存者的病毒RNA检测结果也与恒河猴的结果类似。
值得注意的是，研究中所用到恒河猴接有的接受过药物治疗或疫苗免疫，有的未进行任何治疗；而所有的食蟹猴均接受过疫苗免疫。对11只EBOV阳性的恒河猴进一步使用原位杂交ISH和免疫荧光IFA进行复核，结果发现，其中的8只ISH和IFA均为EBOV阳性，并且其中2只（25%）均未进行过药物或疫苗处理。不论是否接收治疗，均可检测到EBOV的持续复制与系统炎症反应。
进一步的研究发现，进行性EBOV可沿着血管结构传播到眼睛，大脑和睾丸，与在人类中观察到的现象类似（图1）。
Figure 1 | Detection of genomic EBOV RNA in the eyes of rhesus monkey survivors by in situ hybridization. Genomic EBOV RNA (red) detected by ISH using an EBOV NP gene-specific probe in haematoxylin-stained (blue) FFPE sections. Single prime figures a′–e′ are insets of a–e at high magnification.
2、CD68+单核巨噬细胞是EBOV在眼睛部位的贮存细胞（图2）
为了确定 EBOV RNA阳性组织是否真的包含EBOV GP1,2 抗原，研究者使用抗 EBOV GP1,2 抗体对幸存者眼部组织进行免疫荧光染色。可检测到幸存者为埃博拉病毒EBOV GP1,2 抗原阳性(图 2 a, b)。树突状细胞被认为是急性 EBOV 感染的主要靶点，HE染色结果提示，在玻璃体与视网膜内可观察到的许多炎症细胞为巨噬细胞的形态学 (图 2 c, d)。为了确定持续性的细胞目标EBOV 感染, 将幸存者眼切片使用抗 EBOV GP1,2 抗体免疫荧光法及抗巨噬细胞/单核分子标记抗体anti-CD68进行染色，结果显示二者的共定位anti-CD68 抗体 (图 2e–h′)。
Figure 2 | Ocular macrophages of survivors express EBOV GP1,2 antigen. a, EBOV GP1,2 antigen (red) staining in a cluster of likely inflammatory cells, including macrophages adjacent to the inner limiting membrane of the retina (labelled using a GFAP antibody, green). Blue DAPI stain identifies nuclei .
3、埃博拉病毒持续性感染会引发幸存者眼部的葡萄膜炎、视网膜色素等伴有反应性胶质（图3）
8只幸存猴中6只具有严重的葡萄膜炎、4只发生了视网膜炎。与对照组相比，在睫状体, 虹膜和巩膜内被发现靠近房角出现明显的炎症细胞浸润， 包括巨噬细胞。CD68 染色结果显示，一些膜浸润细胞为巨噬或单核。
上调和细胞增殖都是急性视网膜损伤或慢性神经元后的反应性胶质应激反应。为了概述六幸存者的视网膜结构，研究者使用胶质纤维酸性蛋白抗体进行了染色，结果发现上调胶质蛋白免疫反应明显扩展到内外核的细胞过程层。一些视网膜细胞被贴上细胞增殖的标签标记 Ki67 , 提示细胞增殖在 EBOV 持续期间激活维持视网膜稳态。
Figure 3 | Persistent EBOV infection causes uveitis, retinitis and vitritis accompanied by reactive gliosis.
4、埃博拉病毒持续存在一只恒河猴幸存者的脑部（图4）
曾有研究报道埃博拉病毒在幸存人类的中枢神经中存在持续复制，但是病毒是如果突破血脑屏障到达免疫豁免部位并造成持续感染的机制仍不清楚。本研究确定了一只幸存的恒河猴在EBOV感染后第36天的脑纹状体可检测到EBOV核酸阳性。通过RNA原位杂交、EBOV GP1,2 抗原、血管内皮标签CD31 抗体以及和CD68+抗体免疫荧光检测，验证并提出，EBOV是通过血管内皮细胞的感染突破血脑屏障进而感染大脑纹状体，并导致随后的致随后组织炎症和小胶质细胞的感染。
Figure 4 | Ebola virus persistence in the brain of a rhesus monkey survivor.
a, EBOV genomic RNA detection by ISH in a glial nodule in the corpus striatum of brain. Inset: image at high magnification (scale bar, 100 μm). b–b‴, Immunofluorescence staining reveals EBOV GP1,2 antigen (green) in CD68+ microglia(red) or extracellularly within a glial nodule (scale bars, 50 μm (b) and 5 μm (b‴)). Blue, nuclear stain by DAPI.
5、埃博拉病毒持续存在恒河猴幸存者的睾丸中（图5）
研究在一只幸存的恒河猴在EBOV感染后第43天的睾丸中可检测到EBOV核酸阳性。已有报道在EBOV感染幸存的人类中曾检测到间质性感染和生精小管感染并导致再次感染的死亡。本研究通过EBOV GP1,2 抗原和 CD68+免疫荧光检测结果也显示类似的结果。
Figure 5 | EBOV persistently infects the epididymis of a rhesus monkey survivor
6、埃博拉病毒持续存在恒河猴幸存者的免疫豁免部位（图6）
为了进一步了解EBOV是否确实能在免疫豁免部位进行有效的复制与持久存在，研究者开发了一种多重荧光原位杂交（fish）以区分基因组与抗EBOV病毒基因组。结果发现，可在幸存恒河猴的眼睛, 附睾和大脑中同时检测到EBOV的RNA，不仅检测到了ebov基因组, 也可检测到EBOV的antigenome。有趣的是，两个幸存者的眼睛部位EBOV的复制水平较高，另外两个则较低，更高病毒复制的水平与更严重的炎症相相吻合。
Figure 6 | EBOV replicates in the eyes, epididymides and brains of rhesus monkey survivors. a–f‴, Multiplex FISH was used to detect EBOV genome (red) and antigenome/mRNA (green) in eyes (a–d‴), tubular lumen of the epididymis (e–e‴) and brain (f–f‴) (scale bars, 10 μm (c′,d‴,e‴,f‴), 20 μm (a,b′,c,d), 50 μm (b,f), 100 μm in (e)). Blue, nuclear stain by DAPI. g, Quantification of the FISH intensity ratio between EBOV antigenome/mRNA and genome signals.Data are presented as mean ± s.e.m. (n = 13, 32, 36, 22).
小结：
本研究发现感染埃博拉病毒后存活的无症状的恒河猴中，不论是否接收治疗，均可检测到EBOV的持续复制与系统炎症反应。此外，本研究的数据表明，EBOV可沿着血管结构传播到眼睛，大脑和睾丸，与在人类中观察到的现象类似。此外，研究还证实了CD68+细胞（单核巨噬细胞）是EBOV的贮存细胞，主要分布在玻璃体及其毗邻组织、附睾的管状腔、大脑的组织炎症灶，但不在通常在急性感染期间的器官中。总而言之，研究数据表明，EBOV持续感染恒河猴可以作为EBOV持续感染人模型，并且目前具有良好前景的候选治疗并不能够完全清除EBOV感染。埃博拉病毒的持续性感染的恒河猴动物模型将为研究EBD后遗症奠定基础，并为消除EBOV研发新的治疗方法。
【ABSTRACT】
Ebola virus (EBOV) persistence inasymptomatic humans and Ebola virus disease (EVD) sequelae have emerged assignificant public health concerns since the 2013–2016 EVD outbreak in WesternAfrica. Until now, studying how EBOV disseminates into and persists inimmune-privileged sites was impossible due to the absence of a suitable animalmodel. Here, we detect persistent EBOV replication coinciding with systematicinflammatory responses in otherwise asymptomatic rhesus monkeys that hadsurvived infection in the absence of or after treatment with candidate medicalcountermeasures. We document progressive EBOV dissemination into the eyes, brainand testes through vascular structures, similar to observations in humans. Weidentify CD68+ cells (macrophages/monocytes) as the cryptic EBOV reservoircells in the vitreous humour and its immediately adjacent tissue, in thetubular lumina of the epididymides, and in foci of histiocytic inflammation inthe brain, but not in organs typically affected during acute infection. Inconclusion, our data suggest that persistent EBOV infection in rhesus monkeyscould serve as a model for persistent EBOV infection in humans, and wedemonstrate that promising candidate medical countermeasures may not completelyclear EBOV infection. A rhesus monkey model may lay the foundation to study EVDsequelae and to develop therapies to abolish EBOV persistence.
原文链接:
Xiankun Zeng, Candace D. Blancett, Keith A. Koistinen,Christopher W. Schellhase, Jeremy J. Bearss, Sheli R. Radoshitzky, Shelley P.Honnold, Taylor B. Chance, Travis K. Warren, Jeffrey W. Froude, Kathleen A.Cashman, John M. Dye, Sina Bavari, Gustavo Palacios, Jens H. Kuhn & Mei G.Sun.Identification and pathological characterization of persistent asymptomaticEbola virus infection in rhesus monkeys Nature Microbiology, (2017).
doi:10.1038/nmicrobiol.2017.113 附全文下载链接：http://pan.baidu.com/s/1o8ukZhw
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