病毒云 发表于 2017-8-10 20:46:32

呼吸道合胞病毒空斑实验方法汇总

本帖最后由 病毒云 于 2017-8-10 20:47 编辑

传统的空斑实验方法测呼吸道合胞病毒的pfu值,由于其空斑形成较小,且需要借助特异性的表面融合蛋白抗体来确定,故操作繁琐,费用较高。这里介绍给大家两种简单易行的空斑形成实验操作方法:
方法一:
1. 以5×10e5/ml的密度接种Hep-2细胞到6空板中,每孔加入3ml细胞悬液;
2. 待细胞长成单层后(不得超过48hr),移去营养液,每孔加入400ul的PBS和100ul毒液(10倍系列稀释);
3. 37度,5%CO2,吸附1-4hr,每隔15-30分钟应摇晃板子1次以令病毒分布均匀,病毒在4h时达到最高吸附度;
4. 弃去吸附液,每孔添加覆盖层3ml,少于3ml细胞不易存活。覆盖层以含5%小牛血清的2×DMEM和0.6%的琼脂糖按1:1比例混合而成,这样小牛血清的终浓度为2.5%,琼脂糖为0.3%。琼脂糖必须高压灭菌,用前以微波炉充分融解,并放置65度水浴保温待用。2×DMEM即取1袋干粉DMEM加入500ml去离子水融解即可,其中还可加入双抗或二性霉素等,过滤除菌备用,用时37度预热。二者应充分混合温度不能过高(即无手感为止),否则会摧残细胞;
5. 37度孵育6-7天,到时每孔添加约2ml的1%福尔马林(以0.15M的NaCl配制),固定过夜使之充分渗透过覆盖层。固定时间24hr以上,无上限;
6. 剔除覆盖层,用自来水轻柔的冲洗平板边缘残留的琼脂糖;
7. 每孔添加2-3ml的0.05%中性红。贮存液为10×的,可保存数月之久,工作液以去离子水稀释即可;
8. 室温染色1h-1d,吸掉染液,轻柔地清洗并打开盖子令其干燥后即可保存数年之久;
9. 空斑计算方法同其它方法。
参考文献:Jennifer L. McKimm-Breschkin, A simplified plaque assey for respiratory syncytial virus- direct visualization of plaques without immunostaining, J. Viro Methd. 120(2004) 113-117

病毒云 发表于 2017-8-10 20:48:17

方法二:
1、以5×10e5/ml密度接种Hela细胞于12孔板中,每孔1ml,使之24hr内能长成单层;
2、以2%DMEM(维持液)10倍系列稀释好毒液;
3、吸去生长液,PBS洗涤细胞1-2次,每孔加入维持液500ul;
4、每孔加入稀释好的毒液50ul,充分混匀,每个稀释度做2个复孔,37度,5%CO2吸附2h,每隔5分钟摇晃1次平板,以使之分布均匀;
5、微波炉充分融化无菌的3%琼脂糖,65度水浴保温备用,4%的2×DMEM预热至37度;取1个小培养瓶,分别加入等体积的琼脂糖和DMEM,充分混合至温度适合时每孔加入混合液1ml;
6、室温或4度放置板子致覆盖层完全凝固,然后将之反扣过来,置37度培养4-5天,每天观察细胞情况,注意保证培养箱内有保湿的蒸馏水,否则琼脂糖易干裂;
7、 取出板子,每孔加入100ul的MTT,37度孵育4h,则可见清晰的空斑形成,活细胞染成蓝色,选择空斑不融合且分散单个的空斑计数计算pfu值即可。MTT即塞唑兰,100mlDDW加入250mg配成0.25%浓度,-20度冻存备用;
8、pfu计算方法同其它。
参考文献:见重庆医科大学儿童医院免疫室廉国利博士论文《脱氧核酶在小鼠体内抗呼吸道合胞病毒的效应》

病毒云 发表于 2017-8-10 20:48:35

方法三:
1、试验前一天用2 ×105HEP22 细胞接种24 孔板。37 ℃,5 % CO2 培育过夜。Hanks 液冲洗细胞1~2 次,用NaHCO3 调Eagle MEM的pH 值后稀释RSV(10 倍稀释) ,然后加入24 孔板中(设2个复孔) ,吸附1~2 h ,15~30 min 摇动一次以保证
蚀斑分布均匀。
2、以2 倍的Eagle 内加青链霉素、卡那霉素、碳酸氢钠、琼脂糖配成琼脂覆盖层。
3、倒出病毒液,加入琼脂覆盖层0.5 ml ,冷凝后,倒置于34 ℃,5d 后,用福尔马林固定,015 %结晶紫染色。显微镜下数斑。
4、PFU = a1b/ v ( PFU 指每ml 病毒样品空斑形成单位,a 指空斑均数,b 指病毒稀释度的倒数,v 指病毒量。
参考文献:邹毅,黄海鹭,徐军,钟南山;小鼠的原发性呼吸道合胞病毒感染;中华结核和呼吸杂志2001 年8 月第24 卷第8 期。

病毒云 发表于 2017-8-10 20:48:54

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