华人首次发现细丝状病毒颗粒壳体化双链RNA病毒!
编者按：近日， Nature 杂志子刊Nature Communications 刊登了华中农业大学植物科技学院王国平教授研究团队的论文《一个有丝状病毒颗粒的双链RNA病毒》，硕士生荚恒霞为第一作者。该研究首次揭示了线性双链RNA病毒由细丝状颗粒包裹，也是迄今报道的最长的病毒颗粒，也揭示了它可能处于从单链RNA病毒进化到双链RNA病毒的中间状态及与其他双链RNA病毒不同的进化机制。这项工作报告了山茶炭疽菌丝状病毒1（CcFv-1）的线性双链RNA病毒的形态及进化特征，为病毒世界的多样性提供了重要的补充。研究人员首先从湖北宜昌的茶叶中分离出山茶炭疽菌LT-3-1株 和 DP-3-1株，又把菌丝接种于玻璃纸膜在PDA平板25℃黑暗中4-5天，然后收集保存于液氮中。这些收集物被用于双链RNA提取和蛋白质消除。双链RNA随后被除去剩余核糖体的RNA和DNA及进行了酶处理。
为了纯化病毒颗粒，菌丝粉末混合于磷酸盐缓冲液，离心12096×g 30 min以除去细胞碎片。研究者进一步超速离心上清物，沉积物用PB缓冲液收集。这个粗提物用蔗糖密度梯度离心进行病毒纯化。纯化的病毒颗粒用1%乙酸双氧铀负染在碳包被的400个网眼的铜网格上，且用透射电子显微镜检查，用ImageJ 1.43进行了颗粒长度和宽度的测量。
图1 从山茶炭疽菌LT-3-1株提取的病毒样颗粒的透射电镜图像
接着，研究者进行了克隆和测序（图2）。双链RNA的互补DNA的全长由每个单独纯化的双链RNA扩增（RT-PCR）得到的部分cDNA的装配及cDNA末端快速扩增法（RACE）决定。分析结果表明双链RNA1-8是山茶炭疽菌LT-3-1株（一个新的双链RNA病毒）的基因组成成份，研究者将其命名为山茶炭疽菌丝状病毒1（CcFv-1），因其病毒体的形态。
图2双链RNA1-8编码链的末端区域的多重比对
研究者又对病毒颗粒的双链RNA和蛋白质进行了分析。用琼脂糖凝胶电泳分析核酸，用12%SDS-PAGE分析蛋白质。蛋白的胶在电泳后，用考马斯亮蓝染色，蛋白条带被单独地切割再进行PMF分析。
进一步，研究者进行了多克隆抗体产生和免疫吸附电镜实验（图3）。他们从山茶炭疽菌丝状病毒1（CcFv-1）感染的株LT-3-1提取出P4蛋白，且用蔗糖密度梯度离心纯化。SDS-PAGE分离之后，包含P4的胶带被切离用于抗体准备。总共300µg P4蛋白分四次注入两只三周大雌性BALB/C老鼠，已产生多克隆抗体（PAb-P4)。从CcFV-1感染和没感染的分离株准备蛋白，提取于蔗糖密度梯度离心后的蔗糖片段。这些蛋白用直接ELISA法和稀释范围从1：50到1：512，000的多克隆抗体反应，以估计最佳滴度。他们还应用了Western-blotting和免疫吸附电镜实验。
图3 抗CcFV-1 P4的一个多克隆抗体的滴度定量和Western blot 分析（a）及病毒颗粒的免疫电镜分析（b-d）
研究者还进行了CcFv-1双链RNA的消除实验。山茶炭疽菌LT-3-1株的菌丝在PDA上25℃生长在一个24小时的光周期下长达1个月，直到孢子形成。培养末期，分生孢子被收集，且培养于PDA平板25℃于黑暗中24小时。形成的小克隆分别地转染于新的PDA平板，用于双链RNA提取。提取的双链RNA用1.2%琼脂糖电泳分析，用EB染色观察，用RT-PCR进一步鉴定。
为分析真菌毒株的生物学特征，研究者估计了培养了4天的菌丝在PDA上黑暗中培养3-5天的形态学和生长速率，一式三份（图4）。毒株的毒力是通过接种菌丝于分开的茶树叶上来确定的，发生的病变在接种后4天被测量和拍照。
图4 茶叶上不同山茶炭疽菌毒株的菌落形态、PDA平板生长速率和病变长度
为了用双链RNA和病毒颗粒转染，研究者从活跃生长的LT-3-1D2 株、一个从分离株LT-3-1分生孢子再生的子分离株、或DP-3-1 株来准备原生质体。原生质体被微孔过滤器过滤，使用一个血细胞计数器在100倍的显微镜下计数，且被用于双链RNA转染。总共2.0×106原生质体，用5-7µg酶处理过双链RNA（包含双链RNA1-8）或者70-80µg病毒样颗粒。转染之后，原生质体的混悬剂用无菌水稀释，在PDA平板上铺开用于形成克隆。新克隆分别地培养于新的PDA平板，用于双链RNA提取。
综上，这项研究首次揭示了双链RNA病毒由细长弯曲的颗粒包被，且CcFV-1 的病毒颗粒为目前已知最长。进一步的研究需要明确是否存在一个新的基因组包装机制或者涉及一个新的蛋白质亚单位的排列。
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