Nature深度综述：溶瘤病毒能怎样协助免疫疗法？
肿瘤免疫疗法在近年来取得了一系列进展，改变了许多癌症的治疗格局。但与此同时，肿瘤免疫疗法也暴露出了作用人群不够广泛等瓶颈，限制了它的应用。为了让其发挥出更大的潜力，研发人员们正在为它寻找帮手，形成更为有效的组合疗法。而在诸多潜在的好帮手中，溶瘤病毒是最为引人关注的新疗法之一。近日，《Nature Reviews | Cancer》刊登了一篇综述，介绍了溶瘤病毒在未来免疫组合疗法中的广阔应用前景。在今天的这篇文章中，我们也将为各位读者整理其中的内容。溶瘤病毒与常见靶向机理
顾名思义，溶瘤病毒指的是一类能够有效感染并消灭癌细胞的病毒。由于病毒的特性，这种疗法既可以系统施用，也可以局部施用，对原发和转移性肿瘤进行治疗。当癌细胞在病毒的感染下破裂死亡时，新生成的病毒颗粒会被释放，进一步感染周围的癌细胞。从机理上看，它不仅能对肿瘤进行直接杀伤，还有望刺激人体的免疫反应，增强抗肿瘤效果。
为了让溶瘤病毒有效地针对癌细胞，对肿瘤的特异性靶向是研发中的一大重点。有趣的是，肿瘤天生就很适合成为溶瘤病毒的攻击对象——当诸如RAS、TP53、RB1、以及PTEN等基因出现变异后，癌细胞的抗病毒感染能力会变弱，给了溶瘤病毒可乘之机。
针对癌细胞的这些弱点，我们已经开发出了多种能有效靶向肿瘤的病毒。譬如，水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）和马拉巴病毒（Maraba virus）等经过改造的弹状病毒（rhabdoviruses）能依赖干扰素信号通路的缺陷，特异性地靶向癌细胞。而首款得到美国FDA批准治疗黑色素瘤的溶瘤病毒，则是由单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1，HSV-1）改造而来。这些病毒的设计都与免疫反应有关。
另一些溶瘤病毒则能额外针对恶性肿瘤的代谢异常。比如pexastimogene devacirepvec（Pexa-Vec）自身带有一个缺陷的胸苷激酶基因，因此它只能在具有过量胸苷激酶活性的癌细胞中复制。此外，这款病毒中的B18R基因带有一个提前的终止密码子，让它的编码蛋白不容易被干扰素识别与结合。这些特性让此类病毒能有效地针对肿瘤细胞，而将对正常细胞的影响降至最低。
溶瘤病毒与免疫疗法
在这篇综述中，作者们指出，T细胞想要触发成功的抗肿瘤反应，必须得经历四个关键步骤。而溶瘤病毒能在这四个步骤中对T细胞进行协助。
1. T细胞致敏（T cell priming）
T细胞反应的启动，离不开对特定抗原表位的识别，而这个复杂过程离不开抗原呈递细胞的工作。在癌症中，抗原呈递的过程往往会受到负面影响，让肿瘤在免疫学上“冷下来”。而溶瘤病毒可以实现类似于“疫苗”的作用，促进肿瘤相关抗原的呈递与识别。
正如上文中提到的那样，局部的溶瘤病毒治疗，可以通过裂解癌细胞，释放出大量肿瘤相关抗原，并创造一个亲免疫的细胞因子环境，便于抗原呈递细胞实现它们的功能。这一设想已经在不少实验中得到了验证。一些研究人员发现，脊髓灰质炎病毒（poliovirus）与弹状病毒的嵌合能导致肿瘤抗原的释放，并催生I类干扰素反应。这些刺激最终会诱导肿瘤特异的T细胞群体增生。
研究人员们指出，这一方法的优点在于，我们不需要对肿瘤相关抗原有事先的了解，因此是一种简便的个体化疫苗开发手段。但我们也要注意，此类方法未必能诱导足够的T细胞反应。为此，研究人员认为在溶瘤病毒中加入肿瘤相关病毒载体，或许能提高效果。
2. 移动与浸润（trafficking and infiltration）
在循环中的T细胞能移动到肿瘤位点进行浸润，对患者的预后有举足轻重的作用。而溶瘤病毒的使用，有望增强T细胞对肿瘤的浸润。这背后有着多种潜在的机制。
首先，病毒感染能激发潜在的I类干扰素反应，刺激趋化因子的生成，从而募集T细胞。在动物模型中，无论是腺病毒、HSV-1、牛痘病毒、还是新城疫病毒（Newcastle disease virus），都能有效地提高T细胞的浸润。此外，溶瘤病毒在临床试验中，也证实能在黑色素瘤与其他晚期癌种里，提高T细胞的浸润。而对于大脑肿瘤，科学家们也同样在一些研究中观察到了积极的成效。
其次，溶瘤病毒能诱发TNF、IL-1β、以及补体的反应，上调内皮细胞上选择素的表达，为T细胞的浸润提供关键信号。
第三，溶瘤病毒通过改造，有望针对特定的致癌信号通路。举例来说，WNT–β-catenin通路具有免疫抑制的效果，且能抑制细胞的抗病毒反应。通过改造，不少溶瘤病毒能被β-catenin信号通路激活，促进肿瘤特异的病毒复制与抗肿瘤效果。
第四，溶瘤病毒能编码T细胞趋化剂，有望直接招募T细胞，而不必担心肿瘤环境中的趋化因子表达缺陷。
在这篇综述中，研究人员们也指出，肿瘤病毒也能协助克服组织结构上的障碍，进一步帮助T细胞浸润。比如它能够吸引嗜中性粒细胞在肿瘤微环境中释放炎性介质（inflammatory mediators）以及带有细胞毒性和细胞外基质（ECM）降解属性的蛋白酶。
3. 规避免疫抑制（circumventing immune suppression）
即便T细胞成功在溶瘤内取得了浸润，依旧不代表它们就能有效对肿瘤展开攻击。研究人员们指出，在进入到肿瘤后，T细胞依然需要克服环境中具有免疫抑制性的分子，如IL-10、TGF β、以及IDO。
在这方面，溶瘤病毒有望诱导亲炎性辅助T细胞1（pro-inflammatory T helper 1），从而改变抑制性的肿瘤微环境。此外，它也有望直接杀死免疫抑制性的细胞。
其中，最受人关注的一点可能就是溶瘤病毒将“冷肿瘤”变成“热肿瘤”的能力了。在一项研究中，研究人员们先移除了三阴性乳腺癌患者的肿瘤，并在原位植入了次代肿瘤。后续发现表明，溶瘤病毒的使用让T细胞对肿瘤抗原产生了反应，且能防止肿瘤复发。而且免疫检查点抑制剂的使用，还能进一步增强治疗的效果。其他的一些临床前试验也证明了溶瘤病毒与免疫检查点抑制剂联用的潜力。
在临床试验中，这一潜力再次得到了验证。无论是PD-1抑制剂，还是CTLA4抑制剂，在与talimogene laherparepvec联用的情况下，均能提高患者CD8与CD4阳性T细胞的数量，表明可能带来了系统性的免疫效应。尽管这项试验尚处于1期，但针对晚期黑色素瘤的总体缓解率达到了62%，完全缓解率达到了33%。此外，免疫细胞浸润性低的患者，也同样取得了良好的效果，表明在溶瘤病毒的作用下，“冷肿瘤”对免疫检查点抑制剂也产生了响应。这篇发表在《细胞》上的研究也因此引起了大量关注。
除了让肿瘤从“冷”变“热”外，现有的一些研究也在尝试用溶瘤病毒递送免疫检查点抑制剂的做法。这一做法需要在溶瘤病毒中编码免疫检查点抑制剂，从而避免联合疗法带来的毒性。另外，溶瘤病毒对癌细胞的特异性，能更有的放矢地在正确的地点释放药物。目前，已经有两项研究进行了初步的尝试。但我们也要承认，这个想法在技术与机制上还有不少挑战有待解决。
4. 结合肿瘤细胞（engagement of tumour cells）
成功免疫疗法的最后一步，在于T细胞对肿瘤细胞的识别、结合、以及攻击。为了躲避T细胞的识别，肿瘤细胞能下调参与抗原呈递的通路和I类MHC。而溶瘤病毒有望对其进行一定程度的逆转。举例来说，呼肠孤病毒（reovirus）能增加I类MHC与/或II类MHC在肿瘤细胞与抗原呈递细胞上的表达。类似的，被HSV感染的肿瘤细胞能促进树突状细胞的成熟与II类MHC的表达。
本篇综述中，研究人员们还指出，溶瘤病毒有望用一种全新的方法去促进T细胞与肿瘤细胞的结合。目前，有一类叫做双特异性T细胞结合子（Bispecific T cell engagers，BiTE）的分子能结合CD3等激活T细胞的分子，且结合癌细胞表面的抗原靶点。这类创新疗法在血液癌症的治疗中取得了积极的成果，但在实体瘤中的应用却可能受到肿瘤微环境和/或脱靶副作用的限制。编码BiTE的溶瘤病毒有望解决这些瓶颈。
在一项早期研究中，一款能直接结合EPHA2与CD3的BiTE被整合进入了溶瘤病毒，并能在肿瘤细胞处释放BiTE，对未被病毒感染的癌细胞也产生杀伤。另一项研究里，结合EpCAM与CD3的BiTE也能在组织活检样本中激活T细胞。
溶瘤病毒疗法的未来
本篇综述在最后为我们指出了溶瘤病毒的两个潜在发展方向。其一是与T细胞疗法结合，协助T细胞在局部肿瘤微环境中的增殖、移动、实现疗效。其二是通过对免疫机制的进一步了解，我们有望开发出更好的溶瘤病毒，进一步拓展它的潜力。
正如作者们在文章最后所言，毫无疑问，溶瘤病毒的前方充满机遇。我们应当将这一充满潜力的工具与现有疗法进行结合，利用前者对免疫反应的影响能力，对肿瘤残余病灶进行有效的清除。随着免疫系统抗肿瘤机制的不断阐明，溶瘤病毒有望为免疫疗法提供一个重要的平台。
众所周知，FDA已经在2015年批准了首个溶瘤病毒疗法T-VEC，用于不能手术的局部晚期或转移性恶性黑色素瘤，这是一种携带重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的I型单纯疱疹病毒病毒（HSV-1）。
然而，由于T-VEC的疗效未尽如人意，其销售情况与预期有一定的差距。为此，T-VEC正在黑色素瘤和其他实体恶性肿瘤的许多早期和晚期临床试验中进行组合疗法的研究，包括与PD-1单抗（如Keytruda、Opdivo）、CTLA-4单抗（如Yervoy）等免疫检查点抑制剂共同施用，以及与全身化疗或放疗的联合，以求增强临床疗效和扩展适应症。截至目前，已经在几个临床试验中发挥出不错的效果，值得期待。
溶瘤病毒作为单一疗法，仍存在不足
目前，溶瘤病毒（oncolytic virus, OV）作为癌症患者的单一疗法仍然存在许多绊脚石。
首先，OV可以全身给药（静脉注射）或瘤内注射给药，这两种方法都与特定的优点和缺点相关联：
[*]OV的全身给药可以靶向的肿瘤细胞范围更广，但可能受到机体主动防御的限制：（1）机体通过中和抗体或通过循环内的补体激活来隔离病毒颗粒；（2）其他障碍包括：异常肿瘤脉管系统，非靶组织（可能被肺、肝或脾过滤）中的错误定位和隔离，以及循环中不充分的外渗，阻止其进入肿瘤微环境（TME）。
[*]OV局部滴注到肿瘤中可以绕过上述的许多障碍，T-VEC采用的正是此种给药方法。然而，由于许多肿瘤位于体内深处或靠近关键结构，对此进行局部给药是不现实的。
就机制而言，OV可以选择性地复制并杀死肿瘤细胞，并且由于肿瘤相关抗原（TAA）、病原体相关分子模式（PAMPS）和来自裂解的肿瘤细胞的危险相关分子模式（DAMPS）的释放，OV可以刺激对肿瘤细胞的适应性免疫应答。这些反应也使得肿瘤由“冷”变“热”，一旦被抗原呈递细胞（APC）加工，TAA就可以与抗病毒反应同时诱导抗肿瘤T细胞应答。
此外，OV还能够通过治疗性转基因的递送，进一步增强宿主免疫细胞的抗肿瘤活性。
然而，由于溶瘤病毒存在免疫介导的作用机制，它需要相对完整的宿主先天和适应性免疫系统，而这在癌症患者中经常受到损害。OV单一治疗策略对病变的清除是不完整的，特别是对体积大和/或转移的肿瘤，因此还需要额外的治疗来增强其抗肿瘤作用。
CAR -T作为单一疗法，同样存在不足
在过去十年中，CAR -T细胞疗法的临床试验数量不断增多，达到了空前的研发热潮，针对B细胞特异性细胞表面蛋白CD19的自体CAR-T细胞疗法已经成功诱导了难治性B细胞恶性肿瘤患者的持久和深度缓解，例如急性淋巴细胞白血病（ALL）或慢性淋巴细胞白血病（CLL）。
然而，目前尚无大规模有效的实体瘤CAR-T疗法，其中的主要障碍包括：缺乏肿瘤特异性或抗原表达下调；免疫抑制性肿瘤微环境缺乏必要的促炎刺激分子，并且含有丰富的抑制性检查点分子；以及实体肿瘤块的物理屏障。
这意味着，作为单一疗法，CAR-T细胞不足以克服这些抑制机制，因此同样需要额外的治疗手段以增强其抗肿瘤作用。
溶瘤病毒与CAR-T细胞疗法的联合
CAR-T细胞疗法的持久反应取决于供体T细胞的运输和肿瘤中的存活，而OV可以重塑局部肿瘤微环境，改善T细胞募集和效应功能；对OV而言，与CAR-T细胞治疗策略组合可以以互补和相加的方式起作用，克服OV对远处（未治疗）部位的有限抗肿瘤作用的局限性。
OV克服肿瘤微环境的免疫抑制
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免疫抑制性肿瘤微环境
1- T细胞对致密/体积大的肿瘤可及性差；
2- 免疫抑制细胞的存在，如髓源抑制细胞（MDSC）和M2巨噬细胞；
3- MHC-I的表达下调，导致抗原呈递/识别不良；
4- 肿瘤细胞分泌趋化因子吸引免疫抑制细胞，如调节性T细胞（Treg）；
5- 肿瘤细胞分泌抑制性细胞因子，如TGF-β、IL-10；
6- 肿瘤细胞通常缺乏可被内源性T细胞识别的肿瘤特异性抗原；
7- 免疫检查点分子（例如PD-L1）的表达导致T细胞衰竭。
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OV帮助T细胞克服免疫抑制性肿瘤微环境
1- OV通过直接对肿瘤细胞的直接裂解在肿瘤块内产生空间，增加肿瘤可及性；
2- 肿瘤细胞裂解后释放DAMP、PAMP和TAA可以募集APC，并且TAA可将其呈递给淋巴结处的T细胞；
3- OV感染可诱导MHC-I和β2M的表达；
4- 武装OV表达趋化因子以增加内源性T细胞和CAR-T细胞的浸润；
5- 武装OV表达炎性细胞因子以增加肿瘤部位的T细胞增殖；
6- 武装OV表达双特异性T细胞接合物（BiTE）分子以将T细胞重定向至肿瘤特异性抗原；
7- 武装OV表达检查点抑制剂以减轻T细胞衰竭。
临床前研究已经证明，上述组合治疗策略可增强抗肿瘤活性。在黑色素瘤免疫活性小鼠模型中，研究人员证实溶瘤水疱性口炎病毒（oVSV）的瘤内给药促使肿瘤内CD8 +T细胞的增加，与使用热灭活的oVSV或未处理的小鼠（其中值存活期约为20天）的治疗相比，观察到T细胞浸润并且30天内存活率为50％。类似地，输注OT-I（OVA特异性）T细胞在30天内存活率为50％。
而当将oVSV治疗与全身输注OT-I T细胞相结合，50天时存活率约为70％，表明比单药治疗更有效的抗肿瘤反应。在类似的模型中，溶瘤腺病毒的瘤内给药与离体活化的OT-I T细胞结合使内源性CD8 + T细胞的存在增加，促进肿瘤再激活的排斥。
这些结果证明：溶瘤性病毒疗法与CAR-T细胞免疫疗法相结合在免疫活性小鼠模型中是有益的，它们独立地/附加地起作用以控制肿瘤生长。
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溶瘤病毒与CAR-T联合的临床前研究（图片来源：frontier in immunology）
溶瘤病毒联合CAR-T疗法的潜在"武装"策略
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具有转基因的重组溶瘤病毒赋予与CAR-T细胞疗法的直接和间接协同作用
（图片来源：BioMed）
重组基因工程的灵活性极大地促进了溶瘤病毒疗法领域的复兴，目前，许多“武装”治疗基因的OV正在进行临床前和临床研究。
例如，OV感染肿瘤有可能将细胞转化为细胞因子和趋化因子工厂，从而将TME从免疫抑制转变为允许T细胞进入和活化的免疫刺激环境。而这种潜力也创造了OV与CAR-T细胞疗法发挥直接和间接协同作用的机会。
策略一 检查点抑制剂
CAR-T细胞治疗实体瘤的最大障碍之一是肿瘤细胞上抑制性免疫检查点配体的表达，包括CTLA-4、PD-1、B7-H家族成员和Fas配体。这些配体关闭效应T细胞功能，导致它们无法攻击和控制肿瘤细胞。众多临床结果证明，靶向这些免疫检查点分子的抗体可以有效地逆转这种T细胞功能减退，然而这些抗体作为单一疗法时仅对少部分患者适度有效。
同时，有证据表明OV治疗期间PD-L1的表达增加，这可能是潜在的耐药机制。为此，OV与PD-1/L1抗体的联合疗法正在进行广泛的临床试验，并且取得了不俗的疗效。正在进行的临床前研究中，研究人员还探讨了表达PD-1/CTLA-4抗体的CAR-T细胞/OV的疗效。
上海交通大学基因治疗专家蔡宇伽教授领衔的基因治疗公司本导基因也在溶瘤病毒方向有了重要突破，该公司将最先进的基因编辑、合成生物学开关等生物学技术引入溶瘤病毒研发研发管线，使用与免疫检查点技术联合等核心技术以提高抗肿瘤疗效。
策略二 双特异性T细胞接合物（BiTE）分子
双特异性T细胞接合物（BiTE）是由CD3-scFv组成的分子，可以将肿瘤驻留/浸润的T细胞重定向至肿瘤细胞上表达的其他特异性抗原。尽管目前有许多BiTE分子正在开发用于临床，但是可能需要解决全身和频繁输注导致的潜在副作用。
为此，OV已经用于表达各种BiTE分子，可以增加BiTE分子的功效，并减少其全身给药引起的副作用。肿瘤部位BiTE的局部组成型表达将为肿瘤驻留T细胞提供刺激，增加CAR-T细胞的浸润和活化。
策略三 趋化因子/炎性细胞因子
T细胞在肿瘤部位发挥其细胞毒性作用之前，首先必须回到它们的目标并渗入肿瘤块。趋化因子则是将免疫细胞吸引到炎症部位的分子。
最近证实，肿瘤内给予溶瘤性II型单纯疱疹病毒（HSV-2）可诱导多种促炎趋化因子（即CCL2、CCL3、CCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11）的高表达，从而增加内源性T细胞和CAR-T细胞的浸润和持久性。
抑制性肿瘤微环境耗尽了前T细胞细胞因子，这是肿瘤逃避细胞毒性T细胞的显著抑制机制之一。OV可以通过递送炎性细胞因子以刺激肿瘤部位的T细胞并逆转这种无反应性，增加肿瘤部位的T细胞增殖。
结语
虽然肿瘤擅长创造免疫抑制微环境，但将OV与CAR-T细胞免疫治疗相结合或许可以克服这些逃避机制。此外，基于目前部分有待改善的临床试验数据，合理设计OV针对每种CAR构建体和每种靶肿瘤/组织的武装基因，为特定肿瘤靶标提供T细胞最佳协同分子，或许能最大化联合治疗的抗肿瘤效果。
两种疗法作为单一治疗的安全性已在众多临床试验中得到证实，在未来的实体肿瘤临床试验中，OV和CAR-T细胞疗法的组合可能是更安全和更有效的治疗方法。
参考出处：
DOI：10.1038/s41577-018-0014-6
DOI：10.3389/fimmu.2018.02103
DOI：10.1186/s40425-017-0294-6
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