流感病毒聚合酶调控RNA合成机制研究领域取得重要进展
流感病毒是危害全球公共卫生健康的重要病原之一，能在人群中引起大规模流行和季节性流感，每次暴发都会引起人类死亡并造成巨大的经济损失。流感病毒（Influenza virus）是分节段的负链RNA病毒（Segmented Negative-Sense RNA virus, sNSV），属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），目前包括A，B，C和D四种类型。由于流感病毒易发生基因重配和抗原突变，现有疫苗无法提供持久性保护，再加上流感病毒的耐药性问题出现得越来越频繁，开发新型的抗病毒药物已然迫在眉睫。流感病毒聚合酶对于病毒复制增殖和宿主适应都具有重要作用，并且在不同类型流感病毒中较为保守，是抗病毒药物研发的重要靶点。因此对于流感病毒聚合酶工作机制的探索一直是研究热点。 流感病毒聚合酶（Influenza virus polymerase，FluPol）由PA（在C型和D型流感病毒中为P3），PB1和PB2三个亚基组成，并以核糖核酸蛋白（ribonucleoprotein，RNP）复合物形式来行使病毒基因组复制和转录双功能。病毒基因组复制过程可以分为两步：第一步通过结合保守的病毒RNA（viral RNA，vRNA）启动子（promoter）从末端起始从头合成互补RNA（complementary RNA，cRNA）；第二步通过结合保守的cRNA启动子，从内部起始从头合成病毒基因组RNA产物。病毒基因组转录过程则依赖宿主细胞的RNA PolII复合物，通过掠夺并利用宿主来源的加帽RNA（capped RNA）作为引物合成转录产物（messenger RNA，mRNA），从而启动后续病毒蛋白的表达。病毒聚合酶合成RNA过程又可以进一步分为起始，延伸和终止三个阶段。 过去五年里，前人通过晶体学技术成功解析了A，B和C型流感病毒聚合酶的结构，并对它们的复制和转录功能机制有了初步认识，但是关于D型流感病毒聚合酶的研究鲜有报道。同时流感病毒基因组的复制和转录过程是一个极为复杂的过程，除了聚合酶本身，还需要病毒RNA、其他病毒蛋白以及宿主因子的共同参与，才能高效准确地完成这个过程。目前对于这个复杂过程的认知尚有许多空白，亟需研究人员去填补。 为了系统比较不同类型流感病毒聚合酶结构和功能特征以及分析聚合酶在与不同RNA启动子结合时的构象和工作机制，研究人员以D型流感病毒聚合酶为对象来展开研究。首先利用昆虫细胞表达系统，成功纯化得到高纯度聚合酶蛋白并在体外证明其具有生理活性；然后利用冷冻电镜三维重构技术解析了D型流感病毒聚合酶复合体的近原子分辨率三维结构。通过与A，B和C型流感病毒聚合酶的结构比较发现，它们都具有一个保守且构象稳定的核心区域，包括PA/P3亚基的C末端，PB1亚基和PB2亚基的N末端，以及柔性较大的外围结构域，包括PA/P3亚基的内切酶结构域，PB2亚基的帽子结合域和核定位结构域等，提示不同类型的流感病毒聚合酶利用相似的机制合成RNA产物。 为了深入研究流感病毒聚合酶合成RNA的分子机制，研究人员利用冷冻电镜三维重构技术，解析了D型流感病毒聚合酶与不同RNA启动子结合的近原子分辨率三维结构。研究人员首次发现vRNA启动子存在两种不同的结合构象（3’-vRNA能够结合在两个不同的位置），分别定义为mode A和mode B，但是cRNA启动子只采取mode B方式与聚合酶结合（图1）。通过大量的细胞复制子和体外酶活功能实验表明，病毒基因组复制第一步cRNA的合成主要通过mode A构象进行调控，而mode B构象主要在复制第二步聚合酶合成vRNA时发挥作用，并且这一过程需要其他病毒或宿主因子的参与。而病毒基因组转录过程同时受到两种构象的调控。此外，mode A和mode B构象在转运至酶活中心后会共用同一个催化前构象，并且这一构象与mode A的结合位点部分重合（图2）。 值得思考的是，处于mode B构象的3’-RNA位于聚合酶的表面而未进入酶活中心，通过生物膜干涉实验发现3’-RNA与聚合酶亲和能力非常强，那么如何将处于mode B构象的3’-RNA转运至酶活中心？研究人员通过动态光散射实验分析不同状态下D型聚合酶的聚体形式，结果显示在加入启动子后，聚合酶易于形成二聚体甚至寡聚体，并且cRNA启动子更容易诱导这一过程。此前研究也曾报道过A型流感聚合酶能够形成二聚体和四聚体。这些证据提示，不同聚合酶间的相互作用可能诱导其构象变化，从而促进处于mode B构象的3’-RNA转运至酶活中心，但其分子机制还需进一步验证和探索。 此项工作首次系统性地研究了流感病毒聚合酶与不同RNA启动子的相互作用机制，阐明了RNA启动子结合构象在合成不同RNA时所发挥的作用，并提出了聚合酶合成RNA起始阶段的工作模型，推动了人们对流感病毒聚合酶调控不同RNA合成机制的理解，为抗病毒药物开发提供了新靶点。 该研究成果已在线发表在Nature Microbiology杂志上，题为Structural insight into RNA synthesis by influenza D polymerase。中国科学院微生物研究所施一研究组的博士生彭齐、联合培养硕士生刘雨骞和助理研究员彭如超为论文并列第一作者；施一研究员和高福院士为论文共同通讯作者。该研究得到了中国医学科学院病原生物所邓涛研究员，中国科学院生物物理所章新政研究员，南方科技大学冷冻电镜中心王培毅教授，中国科学院微生物所齐建勋和严景华研究员等老师的大力支持，并得到了中国科学院战略先导B专项，国家科技重大专项，中国科学院国际合作重大项目，国家自然科学基金委优秀青年科学基金和中国科学院青年创新促进会等项目支持。
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