蓝耳病的免疫：我们需要知道什么
本帖最后由 序道 于 2015-5-25 19:06 编辑蓝耳病的免疫：我们需要知道什么Michael P. MurtaughphD美国明尼苏达大学兽医和生物医学系教授
猪对PRRSV的免疫应答的知识是从抗病毒免疫系统的标准模型开始的。对宿主细胞的初期感染引发最初的抗病毒应答。最初的防御系统减缓病毒初期复制并且诱发适宜的体液和T细胞调节的免疫应答去消灭病毒。抗体和T细胞对病毒有特异性记忆，使得它们能抵抗以后的感染。然而，对PRRSV的应答在免疫应答的各个阶段都显得有缺陷而且不同。于是带出一系列问题，需要人们提供证据我们缺少对PRRS免疫哪方面的了解
关于对PRRSV的初期免疫应答
初期应答
动物体对病毒侵染的最初应答是产生a干扰素，且经常伴随产生细胞因子，比如肿瘤坏死因子以及白介素1。但是，对PRRSV最初的免疫应答却是零。也不产生a干扰素以及相应的细胞因子。PRRSV感染并不引起1型干扰素在细胞内或胞外的表达。缺少a干扰素的应答是非常重要的，因为a干扰素调节的过程可以在细胞外抑制病毒的复制，并且如用猪的圆环病毒先感染细胞可引发a干扰素的表达，从而一定程度上抑制随之而来的PRRSV病毒的繁殖。此外，对PRRSV无力的最初免疫应答使抗原特异性的体液免疫和细胞免疫都不能达到理想的效果。流感病毒引起机体在肺部有效的表达细胞因子和干扰素，并且在一周内能快速消灭病毒的感染，然而PRRSV的病毒血症在感染6-7周后才被观察到，病毒在最初感染后几个月才能被再分离到。
PRRSV与猪肠胃炎病毒---一种强烈能诱导a干扰素的病毒，双重感染细胞时，能阻止a干扰素的产生。低水平的a干扰素的表达也促进了PRRSV的复制，因为a干扰素表达水平的提升能充分的减少病毒的繁殖以及影响体液免疫应答。另外，最初抗病毒的免疫机制被抑制将增加引起二次感染的可能性。
细胞因子的表达在针对由不同病毒引起的呼吸系统感染的最初应答中是非常重要的。然而，PRRSV的感染却不能引起任何重要的细胞因子的表达。肿瘤坏死因子和白介素-1B是核酸转录因子--NF-kB的重要的催化剂。NF-kB可通过调节多于100种的基因的转录，包括杀伤性和免疫调节性的细胞因子，抗原受体，邻近的分子，细胞凋亡抑制剂，敏锐的阶段性蛋白以及最初效应分子，在初期应答中起到关键作用。由于这些原因，我们推测PRRSV感染后在临床上无明显症状也许是缺少有活性的NF-kB的结果。此外，缺少敏锐的细胞因子表达以及微弱的最初抗病毒能力都是导致抗原特异性免疫应答不理想以及允许能持久性感染存在的原因。
体液应答
抗原特异性的体液免疫最初出现在感染后的7到10天后。由ORF7编码的N蛋白的抗体在体内产生的水平较高，可由血清学方法检测出，但是没有中和性。中和抗体在感染后的14到28天后在血清中出现。对于抗体在抗PRRSV保护性作用过程中有一些矛盾报道，特别是对于在感染后4个星期或更多时间里也许都不出现的PRRSV特异性的中和抗体应答。现在对动物体里中和抗体和血液中的PRRSV病毒的检测都推测中和抗体在预防PRRSV感染中并不起作用。另外，对抗体也许会增强PRRSV在巨噬细胞中复制的观察额外的认为PRRSV 抗体引起了有害的且没有保护力的应答。然而，来自于被免疫后的母猪的初乳对于小猪却可以防止其临床症状的出现以及缩短病毒血症的周期。此外，由初乳提供的抗体不能被检测到的时候保护性也随之消失。对于体液免疫所扮演角色完整的理解和中和抗体特别是起保护性会更加复杂，因为现在缺少对保护性抗原了解，以及抗体达到何种水平才是最有效果的足够信息。此外，PRRSV广泛的抗原和遗传性的变异，以及在农场和生产养殖系统中同时有多种病毒基因型的存在，对体液免疫和细胞免疫都会有不可知的效果。
抗PRRSV的IgM抗体在接种后的5到7天将会出现，在2到3周后将会检测不到其存在。抗PRRSV的IgG在接种后的7到10天首先被检测到，在2到4周后达到顶峰，将会持续数月，到300天降低到低水平。抗PRRSV的IgA将在接种14天后在血清中被检测到，在25天到达最大值，35天后不能被检测到。在肺气管小泡bronchoalveolar lavage (BAL)的洗液里PRRSV抗体的运动的特征和在血清中的十分相似，这表明这些抗体会从动脉管系统中渗出。在气管滤泡中的抗体对清除肺部的PRRSV是有用的，但是并不能完全消灭PRRSV。
能够对病毒感染起中和作用的血清抗体（SN抗体）在病毒感染后3周出现。SN抗体持续较长时间，但是抗体水平低下）。在不同个体中已经观察到SN抗体应答发生的在运动方式以及抗体效价上的变异。Loemba等发现半数接种PRRSV的猪都不能检测到中和抗体，而其他抗体却都相同。Nelson等也报道在进行SN抗体检测时动物体在接种疫苗后不能进行血清转化。PRRSV感染后，在血清中，抗PRRSV的免疫球蛋白主要是抗PRRSV的N蛋白（由orf7编码）和M蛋白（由orf6编码）。针对N蛋白的抗体在感染后的7天被检测到，而M蛋白的抗体将在14天左右出现。对GP5（由orf5编码）特异性的抗体也将感染后7天检测到。
PRRSV的中和抗体被报道对GP5,GP4和Ｍ蛋白都有专一性。对GP5的鼠源的单克隆抗体在对病毒的中和效应上比对GP4的单抗更有作用。此外，SN抗体滴度与GP5抗体滴度有重要的联系，然而与GP4的抗体联系不大。对GP3的抗体也能对PRRSV的感染起到保护性作用，虽然研究的结果并不直接。虽然在中和作用中特异性氨基酸序列的特点还没有被完全了解，但四个实验室证明GP5上线形化的抗原位点是能被中和抗体的识别结合的靶点。
因为中和抗体可能可以将游离的病毒从循环系统中去掉，所以体液免疫被推测在抵抗再次感染和防止或保护病毒在动物之间传播起到重要作用。血清中高滴度的SN抗体可防止由于PRRSV感染造成的呼吸障碍。然而，在预防疾病和在生产过程中保护猪群免受感染的过程中，中和抗体的角色并不清晰。因为病毒血症在SN抗体存在的情况下也能产生，由于PRRSV感染产生的中和抗体也许不足以控制病毒的复制。能逃避中和作用的突变体的选择被认为是中和作用没有效率的一个机制，但是没有逃避中和作用的突变体或在GP5上中和敏锐区域基因发生变异的现象在实验中或实践中被观察到。此外，所有单抗都能和GP5的糖基化和非糖基化区域结合，表明糖基化不能和蛋白的中和表位联系在一起。
中和抗体在肺部和血清中延时出现和在肺与血清中带毒量的变化是有联系的。在肺部病毒量被报道在感染后７到９天达到顶峰，在血清中４天达到最高值，或者在SN抗体首次出现之前的两个星期。这说明，抗体中和作用在对PRRSV的免疫应答中起次要的作用。
抗体依赖性的提高（ADE）现象也会降低中和抗体应答的效力。低效价的抗体会增加病毒粒子与巨噬细胞结合机会。在体外培养中，稀释过的抗PRRSV的抗血清存在的情况下，PRRSV感染肺泡巨噬细胞的能力被显著提高。在攻毒前注射SN抗体的猪，病毒血症的平均水平和持续时间比注射正常IgG的猪严重。长时期的病毒血症和从低水平母源抗体的猪的组织中分离出病毒也表明PRRS的ADE。或者，Ostrowski认为GP5上免疫性的非中和抗原起到诱骗作用，耽搁抗体直接与蛋白上中和抗原表位发生作用。
复制酶复合体特的非结构蛋白（nsp）,特别是编码半胱氨酸激酶的nsp２的多肽,能引起抗体应答。在感染后的１到４周内，抗体识别nsp2中线性的抗原表位并出现。这些抗体在公猪精子能检测到，并且它们的存在与PRRSV在精子中的存在密切相关。现在推测是特异对非结构蛋白的抗体不起保护作用，因为蛋白必须从已死细胞或将死细胞中释放出来与抗体结合。然而，这些抗体也许有诊断方面的价值，可能对T细胞应答是重要的靶点。
细胞免疫应答
PRRSV在肺部感染在大约9天后达到最大值，20天后foci 感染下降到几乎为0，虽然病毒依然可以在以后的时间里在肺部被分离到。在PRRSV感染期间和后期减少的过程中，在肺部的淋巴细胞数量会维持低水平或显著的提高。Samsom等检测到CD8+阳性细胞数量在肺部持续增长。淋巴细胞在CD6-,CD8+的典型细胞表型的基础上被分为各种细胞毒素T细胞。Shimizu等观察到在感染后25-35天CD8+T细胞数量达到顶峰。肺部抗原特异性的淋巴细胞在这里没有被研究。
PRRSV特异性T细胞应答在感染后的第4周首先出现在外周血中。增长的抗原特异性应答将在5到9周后被观察到。抗CD4和抗MHCII的抗体可以分别抑制80%和90%的应答效应，抗CD8和MHCI的抗体分别可抑制50%和75%的应答效率。用同源的病毒再次攻毒可被检测到在外周血单核细胞（PBMC）中引发特异性的应答可维持3周。Lopez等也报道在接种后4周检测到PRRSV特异的淋巴细胞增殖。在这种情况下，应答的T细胞主要以CD4+为主，在感染后的十周都有存在。被刺激的细胞表达r干扰素和白介素2，但没有白介素4或白介素10，这表明CD4+ T细胞对胞内抗原进行细胞调节的免疫应答的特征属于一类细胞因子表达。在体外用PRRSV抗原和白介素2对PBMC进行再次感染产生另人吃惊的现象，应答的细胞主要是CD8+细胞和CD4+CD8+双阳性细胞或者没有天然特异性杀伤能力的CD8+ +细胞。GP5,M蛋白，N蛋白可在相应的应答中诱导引发T细胞的增殖。在疫苗毒系统中分别表达GP2,GP4,GP5,M和N蛋白揭示没有糖基化的M蛋白是诱发T细胞增长的最有效的蛋白，接下来分别是GP5,GP3和GP2，N蛋白的效果最差。
在动物体中对各种病毒感染的细胞免疫应答中，r干扰素起到关键作用。在PRRSV感染的猪的淋巴结，肺部，外周血单核细胞中都可以检测到r干扰素的mRNA.此外，r干扰素抑制PRRSV在体外培养的细胞中增殖。尽管在血清和支气管滤泡液中中和抗体存在，依然可以观察到PRRSV在肺部和淋巴结中的存在。这说明要充分的消灭病毒细胞免疫是不可缺少的。
由于这个原因，我们着手研究在急性感染和持久感染时分泌r干扰素的PRRSV特异性T细胞的动力学状况。在一些幼猪中，少量分泌r干扰素的T细胞首次出现在感染后的２到４周内（每１００万个PBMC中少于100个细胞）。应答有很大的不同，从没有显著变化到高应答（每１００万个PBMC中超过４００个细胞）。在大多数情况下，感染后的３５天后，病毒特异性的T细胞会少于每１００万个PBMC中５０个细胞。所有动物在此时都没有病毒血症。在５到６个月大的幼猪中，一个相似的短暂的T细胞应答被观测到，大约在感染５０到７０天后达到最高值，此时所有动物也没有病毒血症。相对于带毒量大小，PRRSV特异的T细胞在各种淋巴组织中都存在，在急性感染和持久感染中PRRS特异的T 细胞的存在数量是变化的，且与病毒量无关。在急性感染和持久感染中，二级淋巴组织除了扁桃腺外，都被观察到有大量抗原特异性的T细胞的存在。虽然观测到T cells明显的减少，但CD4+和CD8+细胞数量不能改变PRRSV感染状况。我们推测要解决好PRRS感染不能单独依靠T细胞应答。能被PRRSV侵染的巨噬细胞的数量组织中有不同，且不和病毒量一致。这些发现预示，衰弱的T细胞的应答促进了PRRS的长时间的感染，且表明PRRSV抑制T细胞对感染的巨噬细胞的识别。Meier等观察到最初的T细胞对PRRSV的应答是衰弱和短暂的。他们也报道T细胞应答不断增长，比如说在感染后的一两年内特异性的T细胞在１００万个PBMC中超过１０００个。
能促进r干扰素表达的因子能促进抗PRRSV的细胞免疫应答。Foss和Meier报道用白介素１２和r干扰素免疫可提高对病毒特异性的r干扰素的应答。因此，很可能１型干扰素或其他有诱发能力的细胞因子在最初免疫应答中是关键因子，然而在对PRRSV的应答中却缺少。
对PRRSV的免疫应答告诉了我们如何去防治PRRSV?
所有针对PRRSV先天免疫和保护性免疫应答的研究预示猪在感染发生时是不会意识到的。包括炎症反应细胞因子，最终要的a干扰素等那些可以预示病毒感染的先天免疫监督机制在肺部都不被激活。不能引起强烈的干扰素的表达导致抵抗PRRSV感染的第一防线先天细胞抗病毒防御体系的无效。干扰素和炎症反应细胞因子是重要的危险信号去诱发产生保护性免疫应答。因为PRRSV不能诱发先天的警报信号，因此产生保护性应答的过程很缓慢。PRRSV特异性的T细胞和中和抗体在感染后的2到3周内首次出现，而此时肺部病毒量已经降低。这些不强烈的应答与流感病毒的感染过程以及口蹄疫的侵染过程形成鲜明对比，在后两种病毒中，T细胞的应答快速强烈，感染在一周内被消失。
PRRSV在体外培养时增殖效率高，在2到3天内溶解巨噬细胞。因此，对于如果PRRSV能够摧毁肺部巨噬细胞，破坏肺部功能，因此高致死率的烈性感染不用感到惊讶。但是，这却不会发生。反而在保护性应答开始时且超过98%的巨噬细胞未被感染的情况下，肺的功能却逐渐衰退。大多数情况猪可以从急性感染中恢复过来，但感染性的病毒在各个淋巴组织中依然可存在数月直到在120到150天后感染被彻底解决。
在急性感染和持久感染中病毒量会很显著的下降然而却不能通过测定其数量来判断是否依然感染。在肺部病毒量在感染后的7到9天达到顶峰，随后下降。然而肺部依然被感染，要持续40天左右。我们尚未发表的数据显示在肺部和淋巴组织中在感染后的第19天到第67天，PRRSV的病毒量下降10000倍，但是所有动物依然有至少一出淋巴组织处于感染的阳性状态。最近通过用敏感的PCR的方法评价淋巴组织中的病毒量显示猪在感染后的100天依然有PRRSV在淋巴组织中存在。然而，病毒水平很低。这些结果显示虽然不如其他猪病毒能够引起宿主更有效的体液和细胞免疫应答，然而在减少PRRS病毒量的过程中，宿主的应答是有效的。
对病毒量和中和抗体的动态分析显示在急性感染中，抗体不是能够减少病毒血症主要的因素。病毒在淋巴细胞中长时期的存在更显示中和抗体在解决PRRSV感染中是无效的。T细胞应答也同样在消灭病毒上是无效的，因为PRRSV 特异T细胞数量和解决急性感染和持续感染并没有关系。PRRSV 特异T细胞的延迟增长在PRRSV被从机体中清除后才会发生。
这些观察结果表示对PRRSV的保护不是由保护性免疫提供的，而是另有其他。一个可能性是与PRRSV结合的巨噬细胞的变化。有趣的是小鼠乳酸脱氢酶升高症病毒（LDV）和小鼠动脉炎病毒不能引起有效的中和抗体和细胞因子应答，但是可以通过减少能与病毒结合的巨噬细胞的数量来控制。通过减少巨噬细胞来控制PRRSV的感染表明中和抗体和T细胞应答的作用是次要的且很大可能在最后消灭病毒上起作用而不是在大量减少病毒量的过程中。建立在提高保护性免疫应答基础上的免疫控制策略将会讨论与先天免疫机制对比，在控制病毒传播中，中和抗体和非中和性抗体的相关重要性和细胞毒素的意义，比如像天然杀伤细胞和大量的可溶性巨噬细胞。
早期PRRS特点是产生在幼猪中产生轻微的呼吸道病症并且引起长期的繁殖病症。更多毒株在96—97的冬天在美国出现，在2001到2002再次爆发严重的猪死亡。现在还不知道增强型毒株的出现是否是取决于先天免疫系统的改变，包括由于感染出现的巨噬细胞的溶解；或是取决于保护性免疫的改变，或者病毒自身的单独改变。
由疫苗提供的保护
弱毒苗或活苗在减轻病症严重性，病毒血症的持续时间上，病毒扩散和PRRSV 感染的频率上是有效的。中和抗体被推测在抵抗二次感染和保护或减少病毒在动物中的传播起到重要作用，因为他们可以潜在循环系统中清理病毒。由于 PRRSV感染而引起的繁殖失败可以由被动的注入还有高滴度的 SN 抗体来预防。然而，是否中和抗体或细胞毒性T 细胞对保护起重要作用或是甚至在再次感染自然条件下也能起关键作用，这还不清楚。
由活苗和弱毒苗对异源毒株的免疫是一个另人烦恼的问题。实验结果表明免疫异源的疫苗时也能产生高水平的长期保护能力，包括在母猪繁殖阶段。结果也表明可对异源PRRS毒株引起不同的，保护性的记忆性的免疫应答。生产实践中的对PRRSV长期的，地区性特点的观察以及疫苗失败的观点推测保护性免疫也许是免疫应答针对异源PRRSV毒株的变化的的特点。用活苗以及弱毒苗的困难是达不到对PRRS持续有效的控制和预防，使我们意识到对PRRS的免疫还不够了解。这里我们对在感染时的最初免疫的认识有缺陷，包括抗体和细胞毒T细胞的关键免疫靶位点，T细胞介导的保护，调控细胞应答产生和成熟的分子和细胞机制，PRRSV 基因序列变异在免疫保护上的作用，在猪群中免疫系统遗传变异对抵抗PRRSV的影响。因此需要我们开发出效果更好的疫苗。
疫苗用的毒株与野毒株有何不同？
在美国用的疫苗主要是修饰过的活疫苗，它们可产生急性感染并伴随有病毒血症长时期的存在。免疫性的疫苗和带强毒的病毒是相似的，因为都可以同样影响免疫系统，在相同的途径表达相同的抗原。免疫过的动物产生的先天性的和保护性的免疫应答和野毒所产生的免疫应答相同。免疫后动物体内的病毒长期存在于淋巴组织中且传播病毒给其他猪。免疫后的动物对再次感染有抵抗力，虽然保护的水平不完全。免疫疫苗保护能力能对同源性的病毒株的再次感染起到保护作用，也能在养殖场对同源的毒株的感染产生抵抗力。在呼吸病症模型上，对异源毒株几乎都能产生完全的疫苗保护作用，但是在繁殖的模型上只有部分保护力。另外有相似的实验报道对分离到的野毒的部分保护力。由Mengeling和其同事设计的一系列有趣的实验也显示用几种疫苗结合去进行异源免疫会有不同的结果。
造成不同水平的免疫保护程度的原因还没有被研究清楚。Dee 和 Batista在感染PRRSV后免疫猪，并在120天后用相同的毒株或用三株在orf5区域有4到12%的基因差异的毒株攻毒。另人吃惊的是，在病毒血症或抗体应答上并没有显著的不同。除了在PRRSV毒株间抗原的不同，不同程度的免疫保护的原因也许包括猪对PRRSV免疫应答或是对病毒易感能力的先天和后天的变化。对疫苗的不同强度的免疫应答，包括缺少血清转化，是PRRSV对疫苗缺少特异性的特点。
在 PRRSV毒株诱导产生中和抗体中的重要变异，包括没有应答能力，已经被报道。
对PRRSV的免疫取决于保护性应答，建立在抗体和T细胞效应分子的机制上，或者减少与病毒结合的巨噬细胞，它是动脉炎病毒繁殖的特点。不管是何种机制，清楚的是某种免疫记忆的存在为抗再次感染起带作用。
动物年龄与PRRS的免疫反应有关吗？
很多关于PRRS免疫的综述没有将该病的发生分为3个不同的发展阶段：胎儿，青年和育肥猪，成年小母猪和经产母猪。猪的免疫系统在胎儿期开始萌发直到出生后4－8周才发育完全。在子宫中感染但出生时仍存活的猪将会比较虚弱，往往在断奶之前死亡，或成为持续的带毒者。出生后早期感染的猪往往是呼吸道症状。在母猪后期感染表现严重的繁殖障碍，在非孕期或怀孕早期则症状不明显。这些观察结果表明随着年龄增加免疫反应增强，但严重感染的情况效果不明显。但是几分观察报告没有通过明确的答案。胎儿感染引起PRRS病毒特异抗体产生，这与期望中的子宫中的抗原是自身物质的观点相反。在1，4，10周龄感染观察的呼吸道症状和免疫反应没有差异。因此我们不知道动物年龄状态与抗PRRS免疫的介导有什么关系。但这个问题与PRRS的疫苗保护相关。既然疫苗株的病毒抗原变异不大，也许疫苗能够保护异质病毒。宿主自身差异将是影响疫苗免疫效果的关键。
免疫诊断有何用处？
通过ELISA，中和实验和免疫荧光来检测PRRSV的抗体在检测猪群的感染时是有价值的。然而，现在用的检测方法，不能区分疫苗毒和野毒且不能提供野毒中的抗原是否发生变异。病毒的氨基酸组成和序列也已知道，表达病毒蛋白的方法有很多。因此，有理由期待科学家将找出与体液免疫和T细胞免疫有关的抗原蛋白，有助于区分病毒的种类，特别是疫苗毒和野毒。测定由T细胞产生的r干扰素是否对检测病毒有研究还未证实。
我们缺少什么？
PRRSV与猪的作用方式比起其他病毒抗原来明显不同。和几乎其他所有病原相比，它秘密感染不同年龄的猪而不引起最初免疫防御。初次感染后非常微小的抗病毒应答使PRRS可以在肺部和淋巴组织中牢固的存在。T和B细胞应答也失败，因此有效的抗体和细胞毒T细胞应答发展很慢，而且效果很差。所以PRRSV可以在猪体内存在数月。我们缺少对能引发更有效的最初免疫反应的信息，否则可以缩短病毒血症的周期或根除持续感染。现在正在研究最初的危险信号，包括a干扰素和霍乱毒素，是否可以增加疫苗的免疫和保护力。人们期待这些信号能够在感染的时候提高对PRRSV特异的保护性免疫能力。
人吃惊的观察结果即无论是抗体还是T细胞反应都不能理想解决PRRS感染表明提高PRRS感染的免疫我们仍缺乏理论基础。为了寻求更有效的交叉免疫和鉴别诊断，我们需要更多的信息，如单独的病毒粒子蛋白在介导和持续的免疫反应中的作用，关于降低急性和持续感染的免疫机制，PRRS特异免疫的抗体和细胞毒性T细胞的作用，对PRRS不恰当的免疫将会引起急性反应，因为PRRS病毒的变异株很多。直接针对高变区的抗原表位的疫苗和诊断是有效的途径。相反，针对高度保守区的抗原表位能产生很好的交叉免疫保护。这将需要在病毒生命周期以及免疫识别和反应中的高度保守序列有足够的了解。
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