实验－植物病毒的体外抗性
1．目的要求 病毒的稀释限点，致死温度(即失毒温度)和体外存活期测定是病毒生物活性测定的三个重要指标，可作为鉴定病毒的依据之一。其中致死温度较稳定，应用最普遍。本次实验将学习稀释限点、致死温度和体外存活期的测定方法，了解其基本原理及实际意义。2．材料和用具 接种有烟草花叶病毒的烟草病叶，每小组30g； 4—5叶期的心叶烟，磷酸盐缓冲液(0．01M pH7.0 PBS)。低速离心机，天平、恒温水浴、0—100℃的温度计，研钵，薄壁小试管(直径1cm，长5—10cm)及试管架、10毫升的量筒、 2毫升的吸管、小培养皿，洗瓶，烧杯(100ml和250ml)，尼龙纱、小纸签，铅笔，浆糊，金钢砂。普通试管(中型的)及试管架、1毫升的吸管。
3.内容与方法
3．1 致死温度(TIP) 分为8个处理，即50、60、70、80，90，100℃。具体方法如下：
(1)按要求温度调好水温，从10012做起。
(2)将病组织撕碎放入研钵中，加入少许金刚砂，充分研磨使其成为糊状。
(3)将上述病组织糊倒入尼龙纱滤布中挤出汁液。
(4)将病株汁液用o．01M的磷酸盐缓冲液稀释一倍(即两种液体以等量混合)。
5)以每分钟3000转的速度，将稀释后的病株汁液离心30分钟，然后取上面的澄清液进行测定(注意：离心时离心管及所装的液体一定要称重平衡，等重的一对离心管要对称地放在离心机中)。
(6)取8支小试管，在每管中用吸管注入2—3ml(各管用量要一致)的病株澄清液。每种温度处理一管，贴上标签注明温度。
(7)按各管标签上注明的处理温度，在相应的恒温水浴中处理10分钟，处理完后应立即取出试管，用冰水冷却降温。处理时应使试管中的掖面处在水浴水面以下3cm处，处理从100℃开始。
(8)用处理过的汁液(倒在小培养皿中)按照从高温处理到低温处理的顺序，对供试寄主进行接种。如用心叶烟(TMV的枯斑寄主)作测定寄主，每种温度接种3株，每株接种倒数第二，三、四片叶；如用系统感染的昔i6烟草，每种温度接种5株，接种后挂上标签注明处理温度和试验组别或姓名。
(9)将接种后的寄主植物放在20—25℃的温室中，如为心叶烟，在2天以后观察产生枯斑情况，如为普通烟，在7—10天后观察产生系统症状情况。
3．2 稀释限点(DEP) 稀释限点分为8个处理，即不稀释和稀释为10-1，10-2，10-3， 10-4， lO-5， 10-6， 10-7，
(1)将离心后的澄清液按上述处理进行稀释，方法是将8支试管放在试管架上排列一排，除第一个试管以外，后面的7个试管每管加9毫升0.01M磷酸盐缓冲液，然后向第一管中加入未稀释的病株橙清液若干毫升，用吸管给第二管中加入1毫升病株澄清液，并在试管中三吸三放，反复棍合均匀即为10-1稀释液，更换吸管后，从第二管中取1毫升稀释液注入第三管即得10-2稀释液，照此步骤依次稀释成不同的浓度。注意：每次稀释都必须更换吸管。
(2)用各种浓度的病株澄清液接种心叶烟。每种浓度接种3株，每株接种倒数第二、三、四片叶，接种的顺序应从低浓度开始顺次向高浓度进行。为便于操作，接种时可将病株澄清液倒入小培养皿中。
接种后的植株随即挂上标签，注明稀释倍数和实验组别或姓名。
(3)将接种后的植株放在20—25℃条件下， 2—日天后观察和统计各处理产生枯斑的情况和数量。
3．3 体外保毒期或体外存活期(12V) 将挤出的病叶汁液存放在4℃冰箱中，或放在室温中，密封以防蒸发变干，每隔一定时间(一般为每天一次，对TMV则每月一次)接补到敏感的枯斑寄主上，温室培育后记载发病情况。
4．实验时间 2学时。
5.作业与思考题
(1)统计致死温度和稀释限点各处瑚接种寄主叶片上出现的枯斑数或病株数，估计样本的致死温度，稀释限点和体外存活期。
(2)统计各组稀释限点试验中，在心叶烟上出现的枯斑数，绘出枯斑数与稀释倍数的相互关系图，即ID—DI曲线。
(3)为什么各地都有烟草花叶病毒?TMV的传播介体是什么?
(4)体外抗性在病毒鉴定中的重要性如何？
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