变异H3N2致15-16年度流感疫苗组分有变，疫苗株供应或将推迟
第19届流感疫苗研讨会（The19th Meeting Between WHO ERLs, CCs and IFPMA/VE and DCVMN InfluenzaVaccineManufacturers）由英国NIBSC主办，旨在更新第18届流感疫苗研讨会以来的相关议题，就流感病毒、流感疫苗、标准物质研发和疫苗质控方法等研究进展进行研讨。从中检院网站获悉本次会议共有约60名来自世界卫生组织疫苗监管核心实验室、流感参比合作中心（美国、英国、澳大利亚、日本及中国）、药品制造商协会联合会（IFPMA）、发展中国家疫苗生产厂商联盟（DCVMN）以及流感疫苗生产企业的代表参加会议。此系列会议通常结合南半球和北半球季节性流感疫苗毒株的推荐节点，由NIBSC组织每年举办两届，参加各方相对固定，建立了对于流感防控的全面把握和及时沟通机制。我院作为疫苗国家质控实验室首次应邀参加会议。 本次会议的主要内容涉及：全球流感（包括H7N9、H5N1等）流行态势、本年度流感疫苗毒株的确立及筛选、细胞培养流感疫苗研究进展等关键议题，并就流感疫苗效力检测替代方法的进展进行沟通和交流。我院李长贵主任就“H7N9流感病毒疫苗参考品（SRID法）研制”和“流感疫苗效力试验”做大会发言。会议议题如下：一、全球流感疫情的监测
WHO在全球建立了流感疫情监测网络，覆盖几乎所有的国家，每个国家均设有若干个哨点医院，负责采集流感症状患者的样本，各国的CDC系统进行病毒分离并鉴定，同时将结果发送至WHO设立的流感协作中心，其结果作为确定下一年度流感疫苗生产用毒株的依据。此次会议上，各协作中心对2014年度的流感流行情况进行了汇报。总体上，在季节性流感监测中，H1N1亚型和B型病毒分离数量较少，显示其流行程度相对较弱。其中，H1N1亚型病毒变异不大，即使有少量病毒划分为新的基因亚型，但抗原性仍与2009H1N1pdm（2009年大流行流感病毒）一致，显示以往的毒株仍具有充分的保护力。在分离的少量B型病毒中，以Yamagata系为主，与去年推荐的毒株抗原性匹配较佳。但在H3N2亚型病毒的监测中，发现有较大的变异，所分离的病毒大多可划分为两个新的基因亚型，分别为3C.3a和3C.2a,在北美和中国以前者为主，在欧洲以后者为主。两基因亚型的病毒的抗原性与去年毒株的匹配性较差，美国的数据显示其保护效果仅为20~30%，因此在2015年度的季节性流感疫苗中，H3N2亚型毒株的变更将不可避免。另外，此两种病毒的显著特点是在血凝素基因第225位点发生了突变，导致其与红血球的结合能力降低，给毒株的筛选造成了巨大的困难。
在其它类流感病毒的监测中，中国CDC报告了目前我国H7N9的监测情况。目前在中国大陆共发生521例感染，导致192例死亡，病例分布在1~92岁，中位57岁，主要感染老年或有基础病的人群，同时与季节性流感病毒有类似的感染特征，均在冬季达到高峰。2014年度病例主要分布于东南沿海省份及新疆地区，其中多数有家禽接触史或近期到过活禽市场。此外，中国CDC和美国CDC还报告了其它亚型病毒，包括H5N1、H5N2和H10N8等感染人的病例，总体例数较少，主要通过接触家禽感染。
中检院汇报了我国H7N9禽流感疫苗国家参考品的研制及应用情况，包括以重组抗原快速制备抗血清，抗原参考品的两级协作标定，参考品的适用性验证及在注册检定中的应用等内容。中检院的参考品均在2013年底前获得批准，而NIBSC汇报其抗原国际标准品刚刚获得批准。
二、流感疫苗生产用毒株的筛选及检测参考品的制备
结合流感病毒的监测情况，WHO各流感协作中心组织进行生产用毒株的推荐及检测用参考品制备工作。同时，WHO委托少数有经验的机构辅助进行高生产力重配株的制备，即采用具有高产特性的A/PR/8作为亲本株，以流行株作为供体株，两者共感染鸡胚，通过添加针对A/PR/8的抗血清，以筛选出既具有高产特性，又保留流行株抗原性的重配株，以用于每年季节性流感疫苗的生产。本年度碰到的最大难题就是H3N2亚型毒株的制备。通常情况下，在获得重配株后，要对该毒株进行鉴定，确认其高产特性及与推荐相似株在抗原性上的一致性。这需要与相似株病毒免疫雪貂后的抗血清进行抗原性分析，以及本株病毒制备的抗血清与其余株的反应，从而总体上评价抗原一致性。前者为单向检测（OneWay Test）, 两者都进行为双向检测（Two WayTest）。只有通过了双向检测，才能用于疫苗的生产。在抗原性分析中，需检测血凝抑制（HI）抗体滴度。鉴于新分离的H3N2病毒不能结合红血球，因此无法进行HI试验，各机构只能采用噬斑中和方法来检测。实际上，基于传统的HI试验的数据能充分比较抗原性，而中和方法则比较的是交叉中和能力，两者有不同之处。总体上，这些困难延缓了毒株的制备过程，各中心汇报时，有些评价工作尚在进行中，预计在2月26日WHO组织的北半球生产用毒株推荐会议前结束。这比往年的推荐时间晚了两周，部分企业认为这将影响其生产进程。
另外，在重配株产量的评估方面，各实验室所采用的方法不同，有的实验室采用PAGE法，有的实验室采用HPLC或UPLC等方法，导致结果无法比较。因此，在上次会议上提议成立毒种产量评估组（YieldAssessmentGroup），协调采用统一的方法或评估各方法的一致性，此次会议上也报告了初步结果。目前尚没有采用统一的方法，而采用重配株与亲本株A/PR/8的血凝素含量进行比较，其相对值越高则说明毒株产量越高。
在流感疫苗毒株的制备过程中，可能需要各成员国提供分离的病毒。在WHO协调下，多数成员国于2012年签署了名古屋协议（NagoyaProtocol）,承诺分享大流行流感病毒株（H5N1、H7N9等）及相关的信息。但在此协议中并不包含普通的季节性流感病毒，因此，WHO的流感协作中心担心将来可能会出现成员国不愿分享此类病毒的情况。在此次会议上决定，由协作中心协调各成员国签署季节性流感毒株分享协议，此过程需要较多的法律文件和较长的审核过程，将在2015年启动。
三、流感疫苗效力检测替代方法的研究进展
在2009年甲型H1N1流感大流行发生后，WHO未能及时提供检测用参考品，制约了疫苗的研发过程，这促使各机构及企业开展效力试验替代方法的研究。包括采用新的免疫学检测方法和理化检测方法。在2010年渥太华举办的甲流疫苗经验讨论会上，中检院已经汇报了我国的方法及经验，同时各机构也在建立多种方法。此次会议上也专门安排议题，报告这些方法的进展。例如，某公司结合其研制的重组流感疫苗，建立了微阵列芯片（Micro-arrayChip）检测方法，在芯片上包被多个通用抗体，可以实现对疫苗不同亚型的同时检测。在与传统的SRID方法比较中，发现个别型差异较大，芯片检测滴度（Titer ofChip,TOC）高于SRID法。研究者进一步采用高温加速法，模拟样品降解过程，分析了造成差异的原因。另一项研究中，采用针对各基因型病毒的单抗，以ELISA方法检测其中血凝素含量。此外，还有机构在建立竞争ELISA方法，试图减少抗体的使用量，以上研究集中采用了免疫学方法。鉴于方法多种多样，由NIBSC和IFPMA牵头启动了替代方法比较计划（AlternativeAssay Comparison Initiative）,将制备盲样，分发至各研究机构进行评估和比较，这项工作将于2015年开始。面临的难题是需要获得一些样品，另外，样品的实效性（每年更换毒株）也是需要考虑的问题。 看贴回帖是一种美德。
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