[转移贴]e抗原阴性乙型肝炎患者病毒前C区1 896点突变的检测
原贴由一米阳光发表于 2008-12-11 14:34通过本文，我们主要分析报道乙型肝炎病毒(HBV)前C区中最重要、最常见的1 896位点突变在乙肝病毒e抗原(HBeAg)阴性的乙肝患者中的检测结果。
一、材料和方法
1.病例来源：均来自本院门诊及住院病人，随机取材。
2.引物设计：共设计两对引物，第一对用于扩增HBeAg阴性的乙肝患者血清中的HBV DNA，P1位于1 865到1 889，P3位于2 410到2 430，扩增片断为566 bp；第二对引物用于检测1 896 G～A点突变是否发生：利用PCR扩增引物3′端碱基必须与模板配对才能进行PCR扩增的原理，在1 876～1 896位设定PCR上游引物P2，且3′末端设定为突变碱基A，下游引物与P3通用。而未发生1 896突变的HBV进行PCR扩增不会出现阳性结果，只对1 896 G～A突变病毒进行特异性扩增。P2、P3引物PCR扩增片断为552 bp。所有引物由上海细胞生物研究所合成。
3.实验方法：酶联免疫吸附测定(ELISA)方法筛选符合实验要求的乙肝患者血清标本(HBeAg阴性)1 017份(试剂由上海科华实业有限公司生产)；P1、P3引物对PCR扩增其中的HBV DNA(包括野生株和变异株)；对HBV DNA阳性血清，利用P2、P3引物对PCR检测其中的HBV是否有1 896位点突变，同时在RA 1 000型自动生化分析仪上检测血清中的谷氨酰氨基转移酶(ALT)。
二、结果
1.对1 017例HBeAg阴性的乙肝患者，以P1、P2引物进行PCR扩增，扩增出78份HBV DNA阳性，阳性率达7.7%。扩增产物与标准品对照，为566 bp，与预期相符。
2.78例HBV DNA阳性血清，同时进行1 896位突变点检测和ALT测定。结果有63例出现了1 896位点突变。占所有待检血清的6.2%，占DNA阳性血清的80.8%(63/78)。在分布上不存在年龄和性别差异。59例血清中ALT＞45IU/L，其中感染HBV变异株血清中56份异常，占88.8%。15例感染野生株且DNA阳性血清中，仅3例ALT异常，占20.0%。ALT指标在2种患者中比较，差异有非常显著意义(P＜0.01)。
三、讨论
通过上述研究发现，7.7%HBeAg阴性的乙肝患者HBV DNA阳性。由此可见HBeAg阴性不能作为诊治病情的唯一指标。前C区中1 896 G→7A位点突变最重要，因为它使前C区编码第28位色氨酸密码子变成了终止密码子TAG，使病毒不能在肝细胞内合成完整的HBeAg分泌入血清中。在Horikita的研究中，8例抗-HBe阳性病例中6例出现该点突变，而我们所研究的1 017份HBeAg阴性的乙肝患者血清中，63例出现了1 896位点突变，占6.2%，占HBV DNA阳性血清中的80.8%。
Omata等研究发现前C区的突变常导致患者病情加重。我们的结果发现，63例变异株感染患者中56例(88.8%)ALT高于正常，而15例DNA阳性野生株感染患者中仅3例(20.0%)ALT异常。 一米阳光发表于 2008-12-11 14:40：
Precore Mutations Occur Early in HBV Infection but Do Not Worsen Outcomes
By Brian Boyle, MD
Hepatitis B virus (HBV) precore mutants have been detected in 4%–10% of hepatitis B e antigen (HBeAg)-positive patients. It is currently thought that precore mutants emerge due to the selective pressure that occurs during the process of HBeAg seroconversion. Some studies have suggested that precore mutants are associated with more severe HBV-related liver disease, however, other studies have not confirmed this finding.
In a study published in The Journal of Infectious Diseases, investigators sought to assess the relationship between the development of precore and core promoter mutants and HBeAg seroconversion and the clinical effect of these mutations. The study enrolled 376 Chinese patients with chronic HBV seen at a hospital in Hong Kong between January 1999 and December 2001. The majority of these patients had no biochemical or clinical evidence of cirrhosis at presentation and subsequent follow-up; however, 20 presented with hepatocellular carcinoma and/or other cirrhosis-related complications, and 24 developed complications during the follow-up period.
The investigators found that 50% of patients <30 years of age had precore mutations and that there was no significant difference in the prevalence of precore mutations between the different age groups. The prevalence of precore mutations was 44.2% among HBeAg–positive patients and 56.5% in anti-HBe–positive patients (p=.031).
There were no significant differences in the alanine aminotransferase (ALT) and HBV DNA levels between patients with and without precore mutations. Further, the median HBV DNA level in anti-HBe–positive patients was elevated irrespective of the presence or absence of precore mutations. Finally, there was no difference in the prevalence of precore mutations between patients with and without complications.
Based upon these findings, the authors conclude, “to our knowledge this study was the first study to show that precore mutations occurred early in chronic HBV infection among the Chinese. The development of cirrhosis related complications and HCC was unrelated to precore mutations, but was probably due to the persistence of significant viremia after HBeAg seroconversion. Core promoter mutations might also play a role.”
10/23/02
Reference
M Yuen and others. Relationship between the Development of Precore and Core Promoter Mutations and Hepatitis B e Antigen Seroconversion in Patients with Chronic Hepatitis B Virus. The Journal of Infectious Diseases. 2002; 86:1335–8.
Copyright 2002 by HIV and Hepatitis. All Rights Reserved.
Reproduction of articles for personal or educational use is encouraged and does not require permission from the publisher. 一米阳光发表于 2008-12-11 14:42：
HBeAg阴性血清中乙肝病毒前C区变异分析
【摘要】目的了解本地区乙型肝炎病毒（HBV）流行株前C（PreC）基因的变异，为临床提供诊疗信息。方法通过设计2条特异性引物进行PCR扩增病人血清中PreC基因序列，回收PCR产物直接进行DNA测序和比对分析。结果PreC变异主要集中在nt 1896位G→A。结论PreC变异可使HBeAg阴转。
【关键词】乙型肝炎病毒；变异；前C基因
A study on the mutations of precore gene of hepatitis B virus genome in e antigen-negative sera
GUO Long-hua，HUANG Xian-zhang，ZHUANG Jun-hua.
Clinical Laboratory，Ersha Island Branch，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510105，China
【Abstract】ObjectiveTo investigate the mutations of precore gene in the e antigen-negative sera of patients with hepatitis B virus（HBV） infectionand provide information for diagnosis and remedy of the diseases.MethodsPrecore gene were amplified by heminested-PCR from e antigen- negative sera and e antigen -postive sera，and the PCR products were sequenced，and the sequences were analysed.ResultsThere was a hot point mutation in nucleotide position 1896G→A in precore gene.ConclusionThe mutations in precore gene an cause e antigen sero conversion.
【Key words】hepatitis B virus;mutation;precore gene
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是不完全双链环状DNA病毒，基因组全长约3.2kb，为已知对人类致病的最小DNA病毒。HBV复制过程中要经过逆转录，由于逆转录酶缺乏有效的碱基校对功能，故HBV基因组比一般DNA病毒易发生变异。给疾病的预防、诊断、治疗和预后带来新的问题。有关HBV基因组的变异，近些年来一直是人们研究的热点。
过去认为乙肝病毒e抗原（HBeAg）阴转，表明病情向好的方面发展。研究证明，如果体内还有HBV在复制，HBeAg阴转往往是HBV在体内发生变异的结果，易使疾病慢性化。HBV PreC基因定位于乙肝病毒基因组nt1814-1900，PreC由于突变，提前出现终止子，HBeAg合成提前终止，影响干扰素疗效［1］。PreC是高变区，研究PreC的变异具有重要的临床意义。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1血清标本
来源于我院门诊和住院病人。
1.1.2主要仪器
Roche公司Light Cycler型荧光定量PCR仪、飞鸽牌TGL-16B台式高速离心机。
1.1.3主要试剂
广州达安基因公司HBV DNA荧光PCR定量检测试剂盒、蛋白酶K（Merck公司）、平衡酚（国产），裂解液（自配）。Taq DNA酶（MBI公司）、dNTP（Promega公司）、PCR产物直接回收试剂盒和DNA Marker（北京天为时代公司）。
1.1.4引物
参照GenBank中的HBV基因组序列，用Primer Premier 5.0软件设计2条特异性引物（半巢式PCR）：正义引物P1:5′-GAC TCT CAG CAA TGT CAA CG-3′（nt 1669-1688）；反义引物P2:5′-TCA TCA ACT CAC CCC AAC AC-3′（nt 2099-2080）；由北京三博远志生物公司合成。设计PCR终产物431bp。
1.2方法
1.2.1标本采集
收集30例HBeAg阴性标本（HBV DNA含量3.0×103~3.1×105copies/ml）和5例HBeAg阳性标本（HBV DNA含量都高于5×105copies/ml，用于对照）。
1.2.2HBV DNA的提取
方法参照文献［2］。
1.2.3PCR扩增
10×缓冲液5μl，P1、P2（5μmol/L）各2μl，dNTP（10mmol/L）1μl，Taq DNA酶（1U/μl）1μl，MgCl2（25 mmol/L）3μl，模板6μl，ddH2O 30μl。加石蜡油30μl，94℃ 5min。然后94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min共循环35次，72℃延伸5min。
1.2.4结果的观察及回收
取第二轮PCR产物在1.2%琼脂凝胶（含EB）上电泳，观察结果。用试剂盒直接回收剩余PCR产物。回收的PCR产物送北京三博远志生物公司用引物P1、P2分别进行正反测序。
2结果
2.1PCR产物电泳结果
见图1。设计产物长431bp，电泳结果与预期一致。
2.2用DNAMAN软件对PreC序列进行比对分析
本次实验共发生4例插入突变。1例标本nt 1825后插入一T，这个位点的插入可同时使X蛋白、HBeAg合成发生移码突变导致X蛋白C端延长20aa，HBeAg发生阴转。3例标本nt 1838后插入A，可使HBeAg合成时移码，HBeAg阴转。
3例标本nt 1814位A→C，使PreC基因起始密码子ATG→CTG，导致HBeAg阴转。如果nt 1896位G→A，使第28位密码子TGG→TAG（终止子），翻译提前终止，这是世界各地报道最多的变异位点，此位点本地变异率为40%（12/30），与广西的报道［3］基本持平。PreC基因其他位点变异基本是同义突变，不会使HBeAg阴转。HBeAg阳性标本PreC未见突变。
3讨论
HBV基因突变可在三个水平上影响HBeAg合成。基本核心启动子（BCP）突变属于在转录水平影响HBeAg合成。PreC基因提前出现终止子、启始密码子变异和移码突变，都可在翻译水平上影响HBeAg的合成。其中最常见的是nt 1896位G→A。如果nt 1862位G→T使第17位密码子由缬氨酸（valine，V）变成苯丙氨酸（phenylalanine，F），HBeAg前体信号肽就不能被切除，从而影响HBeAg分泌，属于翻译后水平上的影响。nt 1862位G→T变异易引发重症肝炎［4］，本次研究未发现此种变异。HBeAg可表达于肝细胞表面，成为细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的靶抗原，或通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）以清除HBeAg感染的肝细胞。如果体内有HBV在复制，HBeAg阴转，反而有助于HBV免疫逃逸。HBeAg阴性的HBV感染者应引起人们重视。由于血液中的HBeAg可以干扰或抑制CTL对肝细胞膜上的HBcAg的攻击，故HBeAg的减少可使CTL对肝细胞膜上的HBcAg攻击得为强烈，从而引起严重的肝损害，导致重症肝炎。
【参考文献】
1 Bayraktar Y，Koseoglu A，Temizer A，et al.Relationship between the serum alamine aminotransferase level at the end of interferon treatment and histologic changes in wild type and precore mutant hepatitis B virus infections.J Viral Hepat，1996，3（3）:137-142.
2 郭龙华，董长垣，高婧，等.从血清标本中快速提取HBV DNA方法的建立.武汉大学学报（医学版），2005，26:344-346.
3 方钟燎，庄辉，杨进业，等.HBeAg阴性慢性乙型肝炎血清HBV前C区的序列分析.中华实验和临床病毒学杂志，2002，16（1）: 90.
4 林裕龙，彭永正，冯桂湘，等.乙型肝炎病毒前C信号肽酶裂解位点变异对HBeAg表达的影响.中华检验医学杂志，2004，27:17-19.
作者单位： 510105 广东广州，广东省中医院二沙岛分院检验科
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