DNA提取中的常见问题分析
提取植物DNA时遇到多糖成分的干扰， DNA质量一直不高，如何消除多糖的影响？参考见解：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA成胶冻状。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比较高，可用以下方法试一试：1、 在 DNA 未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液：100 mmol/LTris -HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗几次。2、 使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。3、 沉淀 DNA 时，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L。或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。4、 多糖和 DNA 的共沉淀物进行再分离。如用 TE缓冲液反复清洗共沉淀 物，将清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或将沉淀物溶解后，经琼脂糖电泳，切下 DNA 部分再将胶回收，或者用多糖水解酶将多糖降解。还 有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖 。 上述方法还可组合使用，以达到最佳效果。然而这些方法均会在一定程度上减低 DNA 的提取量；如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱层析方法，使用对 DNA 具有 特异性吸附的树脂来纯化 DNA。曾有文献提到选用 Wizard Purification Kit，PRC-5 柱 ，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G ，或者 CsCl 梯度离心纯化 DNA。 血样4度保存了2月，现在按照酚常规提取方法不能提取出DNA，有什么解决办法？ 参考见解：按照常规的酚/氯仿法不可能提不出来，下面是参考方法：1、 首先洗出白细胞，最好有1毫升以上血液。2、 加入5ml DNA提取缓冲液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。3、 加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀，50℃水浴过夜。4、 用等体积的（酚，氯仿，异戊醇，25：24：1）混合物抽提一次，5000r/min，10min离心收集水相。5、 取水层，加入3倍体积-20℃预冷无水乙醇5000r/min，10min，75%乙醇5000r/min洗DNA，充分干燥将DNA溶于适量水中。 CTAB法提取水稻基因组DNA， TE 溶解后琼脂糖胶电泳检测，点样孔附近有一条明显的主带。用MBI 公司产的限制性内切酶酶切过夜，鉴定时发现DNA已经被完全切烂，只在溴酚蓝前存在微弱smear状产物。换用NEB 公司产的酶，更换EP管，灭菌水之后重复几次，结果还是如此。拿其他人的DNA 做对照，酶切结果正常。用异丙醇将DNA 重新沉淀，换了TE溶解，检测主带仍旧清晰，可是用酶切之后DNA还是被切烂。为什么？参考见解：1、 公司的酶不行。2、 如做酶切，DNA最好不用异丙醇（因其不易挥发）而用无水乙醇沉淀。3、 酶量大或作用时间太长了。 建议重提DNA，取少许用超纯水溶解（非TE），按照说明书进行酶切。要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性减少DNA的降解； 要得到全血基因组DNA，可以先用分层液密度梯度离心将淋巴细胞分离吗？这样做，与沉淀全血细胞然后破坏红细胞得到的结果有何差异？参考见解：1、 觉得还是先分离细胞好，因为DNA和RNA大都是在细胞核内，有红细胞反而不太好。从血里面提RNA，用淋巴细胞分离液先分离有核细胞的，效果还是不错的。2、 现在提取全血的DNA,也就是提取淋巴细胞中的DNA，用密度梯度离心，只是富积淋巴细胞，能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的话，没必要。3、 如果对基因组的要求不高，可以试试这个方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中，加无菌重蒸水500μl；10 000r/分钟离心3分钟，弃净上清；加20μl 5mol/L KI，旋涡振荡30秒;0.9%NaCl 100μl,150μl氯仿/异戊醇(24∶1)，振荡30秒；10 000r/分钟离心5分钟，吸上清100μl于另一Eppendorf管中，加异丙醇60μl，轻轻混匀，10 000r/分钟离心5分钟，弃上清；加冷无水乙醇1000μl，10 000r/分钟离心5分钟；弃去无水乙醇，37℃烤干；50μl无菌重蒸水或TE，混匀溶解备用。 从经福尔马林处理后的组织标本中提取DNA可以吗？ 参考见解：可以的，国外有好多相关试剂盒，qiagen, roche等公司都有的。 100ml的大量提取，蛋白酶Ｋ是必需的吗？它的作用是什么？用溶菌酶代替可以吗？每次在用酚氯仿异戊醇抽提后，上层里面都是絮状的蛋白质，离心几次都沉淀不下来，请问是哪里出了问题？ 参考见解：一般来说，蛋白酶的作用是将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。而溶菌酶的作用是破坏微生物细胞壁，二者作用各异，不可替代。对于实验中的蛋白问题，建议离心后先用竹签挑出蛋白，小心吸取上层清液，再重复抽提几次试试。 一般植物DNA提取的时候都不加蛋白酶K，这样提出来的DNA链上的组蛋白等未被蛋白酶消化，不是很难除去吗？那DNA是不是不纯？可以用来酶切吗？ 参考见解：蛋白酶k的主要作用并不是消化组蛋白，而是消化细胞，在动物细胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的，植物细胞的较易破碎，不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用：1、 消化组蛋白，释放出DNA。2、 消化DNAse，提高DNA分子量。 建议还是加蛋白酶k为好，这样提出来的 DNA分子量会高一点，且更纯。 提白粉孢子的总DNA，白粉孢子比较小，直接在研磨中加液氮研磨可以吗？ 参考见解：液氮研磨的方法应该可行的，做动物组织，植物组织多采用这种方法，植物纤维一样可以用液氮研磨，要有耐心，边加液氮边研磨，研磨好后再抽提，应该是可以的。 在CTAB法提取DNA时，有一些品种没有DNA析出，是什么原因？ 参考见解：1、 用预冷的异丙醇来沉淀试试，同时研磨的时候要研的非常非常的细。2、 没有看到析出物并不代表没有沉淀，可以继续下一步试验，溶解的时候少加一点儿。3、 高离子强度下DNA与CTAB能形成共沉淀。可能DNA就这样留在沉淀里了。 提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，怎样更好的抑制内源核酸酶的活性？ 参考见解：在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。 用试剂盒对农田土壤的的微生物群落DNA进行提取，虽然总DNA提出来了，可是用细菌的通用引物进行PCR的时候却怎么也扩不出来，请有没有什么好的办法可以解决这个问题？ 参考见解：环境特别是土壤的样品成分复杂，尤其是有腐殖酸具有和DNA类似的性质，因此用一般的国内试剂盒无法提纯。应当选用自制的提取方法，在裂解液中加入要加入PVP。 洗涤后硅胶膜上仍有杂色残留？ 参考见解：细胞裂解不充分，裂解液和样品要快速充分混匀。 洗涤产物中DNA量很少或没有？ 参考见解：1、 样品中细胞或者病毒浓度低。2、 裂解液和样品混合不均匀造成细胞的裂解不充分。3、 蛋白酶K活性下降造成细胞裂解的不充分。4、 温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全，尽量把组织切成小块，延长温浴时间，使裂解物中没有颗粒状物残留。5、 在上柱前，裂解物中没有加乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇。6、 DNA没有有效洗脱，提高洗脱效率，可将离心柱在加入洗脱液后在室温静止至少1min，再离心。7、 洗脱液pH不合适，低pH值会减少DNA产率，确保洗脱液pH在7.0－8.5之间。8洗脱体积太大，超过200ul洗脱体积所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。 A260/280比值较低？或者A260/280比值较高？ 参考见解：用水作为洗脱液比较偏低，或者蛋白质残留，但如果操作过程中使用了苯酚，则更可能是苯酚残留。而比较高可能是大量RNA残留，没有使用RNaseA，或RNaseA活性下降。A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差则为苯酚残留。
谢谢分享，好好学习一下 动物细胞DNA提取的方法，和这个方法一样吗？比如说VERO细胞提取DNA的具体方法能提供一下吗？
还有人用疫苗DNA残留方法能提供一下吗？ 一、基因组DNA提取方法
1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。
2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。
3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,0.5%SDS),混匀。
4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,
5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相
6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。
7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm,离心10min。弃上清。
8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(pH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。
9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。
二、外周血DNA提取技术
1、取静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。
2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。
3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。
4、2500rpm离心10min，弃上清。
5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。
6、3000rpm离心10min，弃上清。
7、倒置离心管，去掉残液。
8、得白细胞，－80℃冻存。
三、氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：
试验试剂：
Ligsis buffer：
133mM NH4ClNHCl7.12g 0.9mM NH4HCO3 NH4HCO 30.071g0.1mMEDTA0.5mM EDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。
ACD抗凝剂：
柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。
提取缓冲液（Extraction buffer）：
10mMTrisCl(PH=8.0) 1MTris.Cl(PH=8.0) 1ml0.1mMEDTA(PH=8.0) 0.5mMEDTA(PH=8.0) 20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌
试验步骤：
1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。
2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。
3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。
4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。
5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。
6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。
7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。
8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC+，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。
9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50-60℃干燥。
10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。
四、NaI提取法提取外周血白细胞基因组：
1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。
2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。
3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。
4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。
5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。
6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。
7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。
五、外周血白细胞基因提取方法：
1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。
2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。
3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。
4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。
六、真核细胞DNA的制备
试剂准备：
1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8); 1mM EDTA(pH8.0)。
2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4); 200mM NaCl;5mMKCl。
3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4、20%SDS
5、2mg/ml蛋白酶K
6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7、无水乙醇、75%乙醇
试验步骤：
材料处理：
1、新鲜或冰冻组织处理：
1)取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。
2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。
3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。
4)60°C水浴1-3hr。
2、培养细胞处理：
1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。
2)离心4000g×5min，去除上清液。
3)加10倍体积的裂解缓冲液。
4)50-55°C水浴1-2hr。
DNA提取：
1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。
2、离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。
3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。
5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。
7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。
8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。
9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。
ghx0123 发表于 2015-9-24 15:03
动物细胞DNA提取的方法，和这个方法一样吗？比如说VERO细胞提取DNA的具体方法能提供一下吗？
还有人用疫苗D ...
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