wwwkkk83 发表于 2015-9-24 08:27:02

DNA提取中的常见问题分析

提取植物DNA时遇到多糖成分的干扰, DNA质量一直不高,如何消除多糖的影响?
    参考见解:一般来说,SDS法提取的DNA会还有较多的多糖,使DNA成胶冻状。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比较高,可用以下方法试一试:1、 在 DNA 未溶出之前,先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液:100 mmol/LTris -HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗几次。2、 使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇,迅速混匀,多糖会先沉淀。3、 沉淀 DNA 时,使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl,或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L。或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000(冰浴 1 h)。4、 多糖和 DNA 的共沉淀物进行再分离。如用 TE缓冲液反复清洗共沉淀 物,将清洗液合并再用醇沉淀 DNA,或将沉淀物溶解后,经琼脂糖电泳,切下 DNA 部分再将胶回收,或者用多糖水解酶将多糖降解。还 有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖 。    上述方法还可组合使用,以达到最佳效果。然而这些方法均会在一定程度上减低 DNA 的提取量;如果材料较少或要求较高,则可考虑用柱层析方法,使用对 DNA 具有 特异性吸附的树脂来纯化 DNA。曾有文献提到选用 Wizard Purification Kit,PRC-5 柱 ,Sephacryl S-1000 或 S-500,Qiagen Genomic tip 500/G ,或者 CsCl 梯度离心纯化 DNA。    血样4度保存了2月,现在按照酚常规提取方法不能提取出DNA,有什么解决办法?    参考见解:按照常规的酚/氯仿法不可能提不出来,下面是参考方法:1、 首先洗出白细胞,最好有1毫升以上血液。2、 加入5ml DNA提取缓冲液,(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。3、 加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀,50℃水浴过夜。4、 用等体积的(酚,氯仿,异戊醇,25:24:1)混合物抽提一次,5000r/min,10min离心收集水相。5、 取水层,加入3倍体积-20℃预冷无水乙醇5000r/min,10min,75%乙醇5000r/min洗DNA,充分干燥将DNA溶于适量水中。     CTAB法提取水稻基因组DNA, TE 溶解后琼脂糖胶电泳检测,点样孔附近有一条明显的主带。用MBI 公司产的限制性内切酶酶切过夜,鉴定时发现DNA已经被完全切烂,只在溴酚蓝前存在微弱smear状产物。换用NEB 公司产的酶,更换EP管,灭菌水之后重复几次,结果还是如此。拿其他人的DNA 做对照,酶切结果正常。用异丙醇将DNA 重新沉淀,换了TE溶解,检测主带仍旧清晰,可是用酶切之后DNA还是被切烂。为什么?参考见解:1、 公司的酶不行。2、 如做酶切,DNA最好不用异丙醇(因其不易挥发)而用无水乙醇沉淀。3、 酶量大或作用时间太长了。    建议重提DNA,取少许用超纯水溶解(非TE),按照说明书进行酶切。要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性减少DNA的降解;    要得到全血基因组DNA,可以先用分层液密度梯度离心将淋巴细胞分离吗?这样做,与沉淀全血细胞然后破坏红细胞得到的结果有何差异?参考见解:1、 觉得还是先分离细胞好,因为DNA和RNA大都是在细胞核内,有红细胞反而不太好。从血里面提RNA,用淋巴细胞分离液先分离有核细胞的,效果还是不错的。2、 现在提取全血的DNA,也就是提取淋巴细胞中的DNA,用密度梯度离心,只是富积淋巴细胞,能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的话,没必要。3、 如果对基因组的要求不高,可以试试这个方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中,加无菌重蒸水500μl;10 000r/分钟离心3分钟,弃净上清;加20μl 5mol/L KI,旋涡振荡30秒;0.9%NaCl 100μl,150μl氯仿/异戊醇(24∶1),振荡30秒;10 000r/分钟离心5分钟,吸上清100μl于另一Eppendorf管中,加异丙醇60μl,轻轻混匀,10 000r/分钟离心5分钟,弃上清;加冷无水乙醇1000μl,10 000r/分钟离心5分钟;弃去无水乙醇,37℃烤干;50μl无菌重蒸水或TE,混匀溶解备用。    从经福尔马林处理后的组织标本中提取DNA可以吗?    参考见解:可以的,国外有好多相关试剂盒,qiagen, roche等公司都有的。    100ml的大量提取,蛋白酶K是必需的吗?它的作用是什么?用溶菌酶代替可以吗?每次在用酚氯仿异戊醇抽提后,上层里面都是絮状的蛋白质,离心几次都沉淀不下来,请问是哪里出了问题?    参考见解:一般来说,蛋白酶的作用是将蛋白质消化成小的片段,促进核酸与蛋白质的分开,同时,也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。而溶菌酶的作用是破坏微生物细胞壁,二者作用各异,不可替代。对于实验中的蛋白问题,建议离心后先用竹签挑出蛋白,小心吸取上层清液,再重复抽提几次试试。    一般植物DNA提取的时候都不加蛋白酶K,这样提出来的DNA链上的组蛋白等未被蛋白酶消化,不是很难除去吗?那DNA是不是不纯?可以用来酶切吗?    参考见解:蛋白酶k的主要作用并不是消化组蛋白,而是消化细胞,在动物细胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的,植物细胞的较易破碎,不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用:1、 消化组蛋白,释放出DNA。2、 消化DNAse,提高DNA分子量。    建议还是加蛋白酶k为好,这样提出来的 DNA分子量会高一点,且更纯。    提白粉孢子的总DNA,白粉孢子比较小,直接在研磨中加液氮研磨可以吗?    参考见解:液氮研磨的方法应该可行的,做动物组织,植物组织多采用这种方法,植物纤维一样可以用液氮研磨,要有耐心,边加液氮边研磨,研磨好后再抽提,应该是可以的。    在CTAB法提取DNA时,有一些品种没有DNA析出,是什么原因?    参考见解:1、 用预冷的异丙醇来沉淀试试,同时研磨的时候要研的非常非常的细。2、 没有看到析出物并不代表没有沉淀,可以继续下一步试验,溶解的时候少加一点儿。3、 高离子强度下DNA与CTAB能形成共沉淀。可能DNA就这样留在沉淀里了。    提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,怎样更好的抑制内源核酸酶的活性?    参考见解:在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。    用试剂盒对农田土壤的的微生物群落DNA进行提取,虽然总DNA提出来了,可是用细菌的通用引物进行PCR的时候却怎么也扩不出来,请有没有什么好的办法可以解决这个问题?    参考见解:环境特别是土壤的样品成分复杂,尤其是有腐殖酸具有和DNA类似的性质,因此用一般的国内试剂盒无法提纯。应当选用自制的提取方法,在裂解液中加入要加入PVP。    洗涤后硅胶膜上仍有杂色残留?    参考见解:细胞裂解不充分,裂解液和样品要快速充分混匀。    洗涤产物中DNA量很少或没有?    参考见解:1、 样品中细胞或者病毒浓度低。2、 裂解液和样品混合不均匀造成细胞的裂解不充分。3、 蛋白酶K活性下降造成细胞裂解的不充分。4、 温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全,尽量把组织切成小块,延长温浴时间,使裂解物中没有颗粒状物残留。5、 在上柱前,裂解物中没有加乙醇,或用低浓度乙醇代替无水乙醇。6、 DNA没有有效洗脱,提高洗脱效率,可将离心柱在加入洗脱液后在室温静止至少1min,再离心。7、 洗脱液pH不合适,低pH值会减少DNA产率,确保洗脱液pH在7.0-8.5之间。8洗脱体积太大,超过200ul洗脱体积所得的DNA浓度会降低,但DNA总量不会减少。    A260/280比值较低?或者A260/280比值较高?    参考见解:用水作为洗脱液比较偏低,或者蛋白质残留,但如果操作过程中使用了苯酚,则更可能是苯酚残留。而比较高可能是大量RNA残留,没有使用RNaseA,或RNaseA活性下降。A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差则为苯酚残留。

ghx0123 发表于 2015-9-24 14:57:42

谢谢分享,好好学习一下

ghx0123 发表于 2015-9-24 15:03:29

动物细胞DNA提取的方法,和这个方法一样吗?比如说VERO细胞提取DNA的具体方法能提供一下吗?
还有人用疫苗DNA残留方法能提供一下吗?

wwwkkk83 发表于 2015-9-24 16:03:06

一、基因组DNA提取方法
1、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。
2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次,离心收集。试验步骤2再重新作一边。
3、加入5mlDNA提取缓冲液,(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,0.5%SDS),混匀。
4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀,50℃水浴3h,
5、用等体积的酚抽提一次,2500rpm离心收集水相,用等体积的(酚,氯仿,异戊醇)混合物抽提一次,2500r/min离心收集水相
6、用等体积的氯仿,异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀,冰浴,10min.。
7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm,离心10min。弃上清。
8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(pH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。
9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

二、外周血DNA提取技术
1、取静脉血5ml,EDTA抗凝,2500rpm离心10min。
2、小心吸取上层血浆,分装到3个0.5ml离心管中。
3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液,摇匀,冰浴15min。
4、2500rpm离心10min,弃上清。
5、加入10ml溶血液,摇匀,冰浴15min。
6、3000rpm离心10min,弃上清。
7、倒置离心管,去掉残液。
8、得白细胞,-80℃冻存。

三、氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA:
试验试剂:
Ligsis buffer:
133mM NH4ClNHCl7.12g 0.9mM NH4HCO3 NH4HCO 30.071g0.1mMEDTA0.5mM EDTA0.2ml;最后加灭菌去离子水至1000ml,高压灭菌。
ACD抗凝剂:
柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g;最后加灭菌去离子水至350ml,高压灭菌。
提取缓冲液(Extraction buffer):
10mMTrisCl(PH=8.0) 1MTris.Cl(PH=8.0) 1ml0.1mMEDTA(PH=8.0) 0.5mMEDTA(PH=8.0) 20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml;最后加灭菌去离子水至100ml,高压灭菌
试验步骤:
1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl,充分颠混至清亮。以4000rpm,离心5min。弃上清液。
2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl,充分匀浆。以6000rpm,离心5min。
3、彻底弃去上清,加入extractionbuffer500μl(裂解细胞),混匀置于37℃,水溶1h。
4、加入8μl的蛋白酶K,颠混,37℃过夜(或55℃,3h,但是37℃效果要好些)。
5、每管加入450μl饱和酚(取溶液下层)缓慢摇晃10min,以5500rpm,离心15min。
6、取上清,每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿-异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离心15min。
7、取上清,每管加入500μl氯仿-异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离心15min。
8、取上清,每管加50μl的3M的NaAC+,适量无水乙醇(预冷)至满,摇匀放入-20℃保存2h以上。
9、以12000rpm,离心20min。去上清,加入70%乙醇500μl,以12000rpm,离心5min,去上清,50-60℃干燥。
10、加入50μl灭菌去离子水,转弹,混匀。

四、NaI提取法提取外周血白细胞基因组:
1、取外周抗凝血(全血)100ul于eppendorf管中,12000rpm离心12min。
2、弃上清,加双蒸水200ul溶解,摇匀20s。
3、混匀后加6MNaI溶液200ul,摇匀20s。
4、加入氯仿/异戊醇(24:1)400ul,边加边摇,摇匀20s,12000rpm离心12min。
5、取上层液350ul,加入另一新eppendorf管中,加0.6倍体积异丙醇,摇匀20s,室温放置15min,静置后的反应体系15000rpm离心12min,使沉淀紧贴eppendorf管壁。
6、弃异丙醇,加70%乙醇1ml(不振动),以15000rpm离心12min。
7、弃乙醇,敞开eppendorf管盖,烘干(37℃恒温箱)后,加1xTE溶液30ul,溶解DNA>12h以上,制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

五、外周血白细胞基因提取方法:
1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中,加入1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS),混匀,3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀,37℃水浴温育1h。
2、将上述DNA提取液混悬白细胞,37℃水浴温育1h后,加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀,液体变粘稠。50℃水浴保温3h,裂解细胞,消化蛋白。保温过程中,应不时上下转动几次,混匀反应液。
3、反应液冷却至室温后,加入等体积的饱和酚溶液,温和地上下转动离心管5-10min,直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min,用大口吸管小心吸取上层粘稠水相,移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿:异戊醇(24:1),上下转动混匀,5000rpm离心15min,用大口吸管小心吸取上层粘稠水相,移至另一离心管中。重复一次。
4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇,室温下慢慢摇动离心管,即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA,转入另一1.5ml离心管中,加70%乙醇0.2ml,以5000rpm离心5min。洗涤DNA,弃上清,去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇,但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动,DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

六、真核细胞DNA的制备
试剂准备:
1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);    1mM EDTA(pH8.0)。
2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);   200mM NaCl;5mMKCl。
3、裂解缓冲液:250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4、20%SDS
5、2mg/ml蛋白酶K
6、Tris饱和酚(pH8.0)、酚/氯仿(酚∶氯仿=1∶1)、氯仿
7、无水乙醇、75%乙醇
试验步骤:
材料处理:
1、新鲜或冰冻组织处理:
1)取组织块0.3-0.5cm3,剪碎,加TE0.5ml,转移到匀浆器中匀浆。
2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。
3)加20%SDS25ml,蛋白酶K(2mg/ml)25ml,混匀。
4)60°C水浴1-3hr。
2、培养细胞处理:
1)将培养细胞悬浮后,用TBS洗涤一次。
2)离心4000g×5min,去除上清液。
3)加10倍体积的裂解缓冲液。
4)50-55°C水浴1-2hr。
DNA提取:
1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min。
2、离心5000g×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中。
3、加等体积饱和酚,混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。
4、加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重复此步骤数次。
5、加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。
6、加1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀。
7、待絮状物出现后,离心5000g×5min,弃上清液。
8、沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g×3min,弃上清液。
9、室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

wwwkkk83 发表于 2015-9-24 16:09:48

ghx0123 发表于 2015-9-24 15:03
动物细胞DNA提取的方法,和这个方法一样吗?比如说VERO细胞提取DNA的具体方法能提供一下吗?
还有人用疫苗D ...

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ghx0123 发表于 2015-9-25 16:25:11

非常感谢您的细心解答,谢谢
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