科研人员发明一种高效安全的新型 RNAi 载体
10月12日，国际学术期刊 Nature Communications 在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所国家蛋白质科学中心（上海）吴立刚研究组的最新研究成果： Ribozyme-enhanced single-stranded Ago2-processed interfering RNA triggers efficient gene silencing with fewer off-target effects ，该成果发明了一种较传统 shRNA（ short hairpin RNA ）更为安全的高效 RNA 干扰（ RNAi ）载体—— saiRNA 。RNAi 是由 siRNA 介导的特异性降解具有互补序列的 RNA ，从而在转录后水平沉默靶基因表达的现象。 RNAi 在真核生物进化中高度保守，目前已被广泛应用于基因功能的研究，并可开发成为小核酸药物直接用于疾病治疗，近期已有几十种 siRNA 药物进入一期或二期临床试验，有望成为续小分子化合物和蛋白质（抗体）药物后的另一类新型的药物，具有很大的应用潜力。 RNAi 发挥基因沉默功能的核心成分是 RISC 复合物，主要由外源提供的 siRNA 与细胞内的 Ago 家族蛋白质组装形成。在哺乳动物中，外源 siRNA 主要通过两种方式获得：一种是通过化学方法直接合成双链 siRNA 分子，通过转染进入细胞质内与 Ago 蛋白结合并沉默靶基因。但化学合成 siRNA 的成本较高，在细胞或动物体内容易被代谢（如核酸酶）清除，作用持续时间较短，且一些类型的原代细胞难以被高效转染，因此在应用上具有一定的局限性。另一种获得 siRNA 的方式是通过 DNA 载体，利用细胞内源的 RNA 聚合酶Ⅲ（ RNA PolⅢ ），如 U6 、H1 等的启动子驱动转录表达 shRNA ，转录产生的发夹状 shRNA 可以被细胞内源的 Dicer 蛋白识别并加工成 siRNA ，然后与 Ago 蛋白结合发挥作用。 shRNA 的表达框不仅可以构建在质粒载体上直接转染细胞进行瞬间基因沉默，还可以构建成慢病毒（lentivirus）载体，能感染大多数种类的宿主细胞并长期沉默靶基因，在高通量的功能基因筛选中有广泛的应用；如果将 shRNA 构建在腺病毒（ADV）和腺相关病毒（AAV）载体上，可以实现在动物整体或特定组织中沉默靶基因。
任何一种技术都有其优点和缺陷， RNAi 技术也不例外。随着其广泛应用， RNAi 的毒副作用逐渐被认识和报道，其来源主要包括两大类：（1）脱靶作用（off-target）。由于 siRNA 不仅可以通过完全互补配对的方式切割靶标 RNA ，还可以通过与 RNA 部分互补配对，以类似 miRNA （microRNA）的作用方式（即2-7位 seed region 的碱基配对）非特异性抑制靶基因以外其它基因的表达。（2）对细胞内源 miRNA 的竞争抑制。由于 shRNA 的加工需要细胞内的 Dicer 、Exportin-5 、Ago 等蛋白质因子协助，而这些蛋白质因子也是细胞内源 miRNA 加工成熟所必须的。由于 miRNA 是细胞功能的重要调控分子，过表达的 shRNA 与内源 miRNA 竞争相同的加工机器，必然对内源 miRNA 的表达和功能造成抑制作用。研究标明，目前常用的传统 shRNA 对细胞内源 miRNA 具有较强的非特异性竞争抑制作用，在小鼠肝脏中长期高表达 shRNA 会造成严重的肝脏损伤并引发肝癌导致动物死亡。因此，如何设计一种更好的 RNAi 载体，在高效沉默靶基因的同时降低其毒副作用，是 RNAi 技术应用中亟待解决的关键科学问题。
吴立刚研究组博士研究生尚仁福等对具有不同茎环结构的 siRNA 前体的加工和功能进行了深入研究，并在此基础上发明了一种比传统 shRNA 效率更高、脱靶作用更少的新型 RNAi 载体。目前被广泛使用的传统 shRNA 具有21 bp 或更长的双链区，这种设计是基于以往的研究结果： shRNA 的双链区如果小于21 bp 就不能被细胞内的 Dicer 有效加工和生成 siRNA 。科研人员在研究中设计 siRNA 前体时，将双链区长度小于21 bp 的 siRNA 的靶向区延伸入顶端环区域，结果双链区为16-18 bp 的 siRNA 前体的加工就不再依赖于 Dicer ，而由 RNAi 的核心蛋白 Ago2 直接在双链区3’臂（3’arm）的第10个碱基位置进行切割，产物被细胞内的外切核酸酶进一步在3’端切短，并最终形成长度为24-27 nt 的单链 siRNA 。他们称具有这种结构特征的 siRNA 前体为 saiRNA （single-stranded Ago2-processed interfering RNA）。 saiRNA 依赖于 Ago2 的加工途径与细胞内一种特殊的 miRNA （miR-451）的加工途径非常类似，而介于 shRNA 和 saiRNA 两种长度之间的 siRNA 前体既不能被 Dicer ，也不能被 Ago2 所加工，因此几乎完全没有沉默活性。进一步研究发现， saiRNA 茎环结构的3’端悬垂（overhang）长度对 Ago2 的结合效率起决定性作用。而通常由 RNA 聚合酶III（polIII）转录生成的 saiRNA 末端有较长的3’端悬垂，无法直接被 Ago2 所高效识别和结合，影响了 saiRNA 的加工和沉默功能。因此，研究人员在 saiRNA 的3’末端融合了一种特殊的核酶（HDV ribozyme，丁型肝炎病毒核酶），利用该核酶的高效自切割活性，准确地在 saiRNA 的3’端产生两个碱基悬垂，大大提高了 saiRNA 前体与 Ago2 蛋白的结合效率，从而显著增强 saiRNA 对靶基因的沉默效率。
核酶增强的 saiRNA 相较于传统的 shRNA 具有以下优点：（1）脱靶作用小。哺乳动物中 Ago 蛋白家族包含四个成员，但其中只有 Ago2 具有 RNAi 活性（切割完全互补配对 RNA 的核酸内切酶活性），而 Ago1、3、4没有 RNAi 活性却会引起较强的脱靶作用。与传统 shRNA 产生的 siRNA 能与所有 Ago 蛋白结合不同， saiRNA 只有与 Ago2 结合后才能被加工产生成熟的 siRNA ，因此有效避免了由 Ago1、3、4介导的脱靶作用。并且其特殊的加工方式只产生一条导向链（guide strand ，具有基因沉默功能的 siRNA 链），不会产生 passenger strand （与 guide strand 互补配对的没有基因沉默功能的 siRNA 链），因此也就完全避免了由 passenger strand 与 Ago 蛋白结合后产生的脱靶作用。（2）对细胞内源 miRNA 的影响小。不论是化学合成的 saiRNA ，还是基于 RNA 聚合酶III的 DNA 表达载体在细胞内转录生成的 saiRNA ，其被加工后产生的 siRNA 的单位浓度分子对靶基因的抑制效率都高于传统的 shRNA 。因此，在同样的沉默效率下， saiRNA 产生的成熟 siRNA 在细胞内的积累量要远低于 shRNA ，避免了占用大量 Ago 蛋白，并且其加工不需要 Dicer 等 miRNA 加工所必须的蛋白质因子，大大减少了对细胞内源 miRNA 加工和功能的竞争作用。
总之，saiRNA 作为一种新型的 RNAi 载体，具有高效和低脱靶的特点，通过对 saiRNA 设计的继续优化，以及动物整体的基因沉默实验，为科学研究和基因治疗应用提供更好的工具。
该研究得到了国家科技部、国家自然科学基金委以及中国科学院的经费支持。
shRNA 和 saiRNA 加工及作用机制示意图。 shRNA 转录后被细胞内的 Dicer 所识别加工后产生双链 siRNA ，其 guide strand 和 passenger strand 都能被细胞内的 Ago1-4 所结合，但只有 Ago2 才能介导与 guide strand 完全互补配对的靶基因 RNA 的切割和沉默作用（ on-target ），而与 guide strand 结合的 Ago1、3、4，以及与 passenger strand 结合的 Ago1-4 都会引起脱靶作用（ off-target ）。 saiRNA 可直接被 Ago2 识别并加工，其特殊的加工过程避免了产生 passenger strand 及其脱靶作用，而且只有与 Ago2 结合的 saiRNA 才能产生 guide strand 去发挥 on-target 的作用，从而大大减少了其它 Ago 蛋白引起的 off-target 作用。 saiRNA 转录后通常具有较长的3’端悬垂，不能被 Ago2 直接识别。通过在 saiRNA 的3’末端融合一个自切割 HDV 核酶，精确产生具有2个碱基的3’端悬垂，大大促进了 saiRNA 与 Ago2 的结合效率，从而显著提高了 saiRNA 的沉默效率。
作者简介：
吴立刚 1996年毕业于上海交通大学生物科学与技术系，获学士学位。2001年毕业于中国科学院上海植物生理研究所遗传学专业，获博士学位。2001年至2008年在美国纽约大学（NYU）医学院从事博士后研究。2008年10月起任中科院上海生科院生化与细胞所研究员，“百人计划”入选者。
本文来源：中国科学院上海生命科学研究院
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