[转移帖]黏膜免疫佐剂及抗原呈递系统研究
原帖由论坛会员Rojjer发表于 2008-2-28 21:43与注射用疫苗相比，黏膜疫苗不仅可以诱导全身免疫应答，还能诱导黏膜免疫应答，这对于阻止病原体通过黏膜的传播和感染具有重要的意义。同时，接种方便，可以避免注射器带来的可能的疾病传染。随着生物工程技术的发展，生产经济、稳定和高效的黏膜疫苗已经成为目前疫苗发展的新趋势。黏膜免疫要取得好的效果，关键是免疫佐剂及抗原呈递系统的优化。好的免疫佐剂可使少量的抗原诱导机体产生早期、高效和持久的免疫应答。因此，安全有效的黏膜免疫佐剂的开发和应用已成为研究的重点之一，本文对黏膜免疫佐剂及抗原呈递系统的研究近况作一综述。
1黏膜免疫佐剂的研究近况
1.1细菌毒素
1.1.1 霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素佐剂效应霍乱毒素(CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是研究较早的黏膜佐剂，分别来自于霍乱弧菌和大肠杆菌，具较强的黏膜佐剂效应。CT和LT的结构有80％的同源性，均由一个A亚单位和一个五聚体B亚单位构成。五个B亚单位聚合形成中空的面包圈样结构，中心与A亚单位非共价键结合。B亚单位有神经节苷脂(GMl)的结合位点，A亚单位有ADP-核糖基转移酶活性，具毒素作用。CT和LT的大致作用过程为B亚单位通过GMl的结合位点与细胞表面的GMl受体结合，通过吞噬作用进入细胞，主动转运至内质网，A亚单位与B亚单位分离，进入细胞质，开始发挥毒素作用。通过结合NAD，ADP-核糖转移酶作用于GTP结合蛋白(Gsa蛋白)，引起腺苷酸环化酶长久活化，细胞内环化腺苷酸无限增加，产生腹泻等毒素效应。CT的A亚单位(CTA)有240个氨基酸，在第192位氨基酸附近被酶解后可以生成CTAl和CTA2两个多肽，CTAl是核糖基转移酶的酶活性部位，而CTA2是与CTB的结合部位。同样，LT由22kDa的A亚单位和每个11.5kDa的五聚体B亚单位构成。
作为已知最强黏膜免疫佐剂，目前认为，CT和LT主要是可提高抗原呈递细胞(APC)呈递抗原的能力。在体外CT可以使肠道上皮细胞转化成为有效的APC，同时刺激人和鼠的树突状细胞(DC)表达MHC/HLA-DR、CD80/B7.1、CD86/B7.2共刺激因子，以及CCR7和CXCR4受体，从而提高APC呈递抗原的能力。同时，CT也可诱导DC分泌白细胞介素1β(IL-1β)。IL—1不仅可诱导DC的成熟，同时和蛋白抗原共同作用时，具有强的黏膜佐剂效应。CT还可通过上调IL-10，下调IL-12，选择性地影响细胞表面分子的表达，抑制Thl细胞的产生，增强T细胞的调节活性。但由于毒素效应，限制了它们在人类中的应用。
1.1.2减毒或无毒CT和LT的衍生物为了避免毒性，人们试图直接把CT和LT的B亚单位用作佐剂。但研究发现，CTB/LTB直接与抗原混合免疫，其佐剂效应弱。若用化学方法或基因重组的方法与抗原结合后其佐剂活性会大大提高，其机理可能是由于结合后的抗原不仅被DC、巨噬细胞有效摄取，还被原初B淋巴细胞有效摄取。有学者用流感病毒HA疫苗PR8H1N1和LTB结合，鼻内免疫小鼠，能在血液、鼻和肺的分泌物中检测到有意义的抗病毒抗体，并可抵抗鼻内病毒的感染L1。但总的来讲，其佐剂效应都较全蛋白弱。
近年来，有学者用位点变异的方法，改变蛋白质的一个氨基酸，干扰A亚单位的ADP核糖基转移酶活性，从而降低毒性。如将LT的A亚单位的第63位丝氨酸变为赖氨酸，第72位的丙氨酸变为精氨酸，分别得到LT和CT的变异株LTK63和LTR72，其毒性下降，鼻内免疫和口服免疫均有佐剂效应。Baudner用LT的无毒变异株LTK63作为C群脑膜炎球菌结合疫苗的佐剂鼻内免疫小鼠也获成功。
Lycke等还提出一种新方法，将CT的A1亚单位和葡萄球菌A蛋白的抗体结合区的二聚体结合，用基因重组的方法得到两者的融合蛋白CTAl-DD，这一融合蛋白可只结合B细胞表面的受体而不是所有有核细胞上的GMl受体，从而可以提高分子的特异性而降低毒性。此佐剂单独应用仅在鼻内免疫时有效，如果将它融合到免疫刺激复合物(ISCOM)上，口服免疫也能诱导出体液及黏膜免疫应答。
Sanchez等根据CT的化学结构，在毒性基团CTAl的氨基端加一多肽，用基因重组的方法在CTAl的氨基端添加一种来自于大肠杆菌的热稳定性肠毒素Sta的类似物，产生的融合蛋白具有免疫原性但毒性降低。这是由于添加的多肽链通过空间位阻效应，抑制了CTAl的活性部位，使其毒性下降。如产生的eCT6变异株同野生型CT相比，肠毒素活性减低10～20倍，但佐剂活性相差不大。而另一无毒变异株eCT23，尽管其佐剂活性较CT和eCT6低，但也优于CTB。
总的来说，LT和CT的佐剂效应是与它们的ADP核糖基转移酶活性密切相关的。随着肠毒素活性的下降，佐剂的活性也随之下降，虽然能用各种方法去毒或者减轻毒性，但佐剂效应也相应下降，因而研究无毒又具有高效的佐剂仍是目前研究的方向。
除CT和LT外，也有学者发现来自于苏云金杆菌的CrylAc前毒素也具有佐剂效应。重组的CrylAc前毒素作为肺炎球菌多糖疫苗的佐剂，鼻内免疫小鼠也能提高特异性黏膜及全身应答。但机制仍不清楚，推测由于CrylAc与内皮细胞的上顶面，包括刷状缘结合，导致细胞电生理性质的短暂改变。
1.2CpG基序
CpG基序又称DNA免疫激活序列(immunostimulatory sequence，ISS)，是一些以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(Cytosine-Phosphate-Guanosine，CpG)为基序的寡脱氧核苷酸(ODN)短序列。其结构特征是5’-嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶-3，，对人及动物具有强烈的免疫刺激功能。CpGDNA可以直接激活APC，诱导其产生IL-12、α肿瘤坏死因子(TNF-α)等Thl型细胞因子，还可间接刺激NK细胞分泌丁干扰素(1FN-γ)，优势诱导Thl型免疫应答。
研究表明，人工合成的具有CpG基序的寡核苷酸，可上调促炎细胞因子以及APC上MHC和共刺激分子的表达，从而诱导非T细胞依赖的B细胞增殖，激活单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。CpG寡核苷酸和抗原一起给予机体，具有较强的佐剂效应。有人用CpGODN和纯化的蛋白抗原鼻内免疫小鼠可以提高黏膜Th2型应答和全身性Thl型应答，并可抵抗小鼠生殖道疱疹病毒感染。
CpGDNA作为佐剂可以诱导强烈的Thl型免疫应答，而且能大规模生产，有望成为安全、有效、经济的新型免疫佐剂。但它在体内激发Thl型免疫应答的安全性尚待通过临床实践来加以认识。
1.3细胞因子
LT和CT是目前已知最强的黏膜佐剂，一般都通过诱导炎症和Thl型细胞因子而发挥佐剂作用。为了减轻毒性，人们试图直接加入信号分子模拟信号发生来产生佐剂效应。研究表明，IL-1可以在鼻内免疫佐剂中代替CT或LT，IL-1和THl型细胞因子(如IL-12、IL-18、GM-CSF)结合，可以提高CTL和IFN-γ的Thl型应答以及黏膜IgA的Th2型应答，产生同CT一样强的佐剂效应。
DC由炎症部位迁移至淋巴结，要受多种细胞因子的调节，DC上有多种受体，如CXCR4、CCR4、CCR7等。CCR7的配体有二级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid tissue chemokine，SLC)和EB病毒诱导的分子1配体趋化因子(Epstein-Barr virus-induced molecule l ligand chemokine，ELC)SLC配体表达于淋巴集结、淋巴结的高内皮小静脉以及脾、淋巴结和淋巴集结的T细胞区域的基质细胞。ELC配体存在于T细胞区域的DC上。SLC和ELC可以引导DC到二级淋巴器官的T细胞区域，通过将编码CCR7配体的基因构建于HSV—2 DNA质粒，鼻内及口服免疫小鼠后也可增强免疫应答。
Lu等根据沙眼衣原体在上皮细胞的复制可以刺激多种细胞因子的分泌，而粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)可以诱导DC成熟，将重组的能表达GM-CSF的活腺病毒肺内感染小鼠后，可以提高沙眼衣原体特异性全身性Thl型应答和局部IgA免疫应答。
2抗原呈递系统
2.1类脂质
最为常用的是脂质体，脂质体是由同心脂质双分子层包围一个水核形成的球形小囊，可以携带脂溶性和水溶性的抗原，将抗原和CTB、IL-12等佐剂包人脂质体可以提高免疫应答。但一般的脂质体口服时易被肠道的磷脂酶所降解，稳定性较差，人们通过改变脂质双分子膜的化学结构，形成多聚脂质体，可以提高稳定性。
ISCOM是直径为30～70nm的立体笼状结构，由混合型脂质、胆固醇和Quil A组成，Quil A本身就具有黏膜佐剂效应。研究证实，ISCOM用于黏膜免疫，可以有效地诱导免疫应答，现正在作临床评估。
2.2生物降解性聚合体微粒
生物降解性聚合体微粒具有抗溶解性，可以控制抗原的缓慢释放，延长疫苗的作用时间，并且可以定植于黏膜表面的M细胞或直接作用于APC，利于微粒的吞噬。生物降解性微粒多由PLGA(polylactide-co-glycolide)构成。Baudner用脱乙酰壳多糖微粒作为呈递系统黏膜免疫也获得成功。
2.3可食用的疫苗
将编码抗原的基因构建于植物，形成可食用的转基因植物疫苗，这一概念首先由Arntzn等于1992年提出。多种病毒的蛋白抗原和LT—B、CT—B均能在转基因植物如西红柿、土豆中产生，将这些植物喂养动物，可以诱导全身及黏膜免疫应答，在有些实验中还能观察到保护性应答。临床试验表明，志愿者服用表达LTB的转基因土豆后可以产生特异性抗LTB的黏膜及全身免疫应答，但如何提高转基因植物的抗原表达量是目前面临的问题。
2.4质粒DNA
将编码抗原的基因构建于质粒DNA，肌注后可诱导免疫应答。质粒DNA疫苗经细胞呈递后，在宿主细胞中诱导被编码抗原的短暂表达，除了诱导体液免疫外，还可诱导细胞免疫，这对于研制针对病毒及细胞内细菌的疫苗有效。小鼠口服PLG包裹的轮状病毒VP6后可以产生全身及黏膜应答。但DNA疫苗同样存在基因融合产生的安全性问题，它的有效性也需要更大规模的实验加以证实。
2.5活的重组载体
用基因工程的方法构建的活重组细菌和病毒载体，其优点是能表达目的抗原，无毒或少毒，但仍能增殖和入侵黏膜表面。因此，一次免疫可在体内复制而引起长久的免疫应答，同时，一个载体可以同时呈递多种抗原，从而一次免疫可预防多种疾病。
研究表明，减毒沙门菌可成功地诱导全身及黏膜应答，Nayak用表达肺炎球菌表面蛋白A的重组沙门菌口服免疫小鼠，可发现其定植于淋巴集结，脾，肝，能诱导全身及黏膜应答，并能抵抗肺炎球菌感染，用相同的菌株口服免疫新西兰白兔可在血液及生殖道中产生特异性抗体。
近来细菌的孢子也被用作疫苗载体。Duc等用表达破伤风毒素C片段(TTFC)抗原的枯草杆菌芽孢，口服及鼻内免疫可以诱导出全身及黏膜免疫应答。血中TTFC特异性IgG在口服后33天升至高峰，可以抵抗致死性TT感染，而抗芽孢衣壳蛋白的抗体量较低。孢子易于生产，可以通过简单的基因扩增的方法得到，而且容易储存，是一种更新的有应用前景的疫苗载体。
重组病毒载体目前研究较多，主要包括腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒等。其中，腺病毒的效果较好，用重组腺病毒[表达猿免疫缺陷病毒(SIV)包裹蛋白)鼻内和口服免疫恒河猴，可以同时诱导全身及黏膜免疫应答，并可抵抗SIV感染。
假病毒，也称为病毒样微粒(VLP)，是新型病毒载体，它是一种体外重组的非复制性病毒核心结构。口服戊型肝炎病毒(HEV)VLP可诱导抗HEV的全身及黏膜应答，不需要另外的佐剂。VLP具有高度免疫原性，易于生产，具有较好的应用价值。
α病毒类载体是一类新兴的疫苗载体，是一种RNA类型的载体，具有RNA自我复制和高效表达的功能，可以特异性地攻击未成熟的DC，从而提高抗原呈递效率。用表达HIV衣壳蛋白的Sindbis病毒的复制子载体，阴道和直肠免疫，均可在阴道黏膜中诱导出衣壳蛋白特异性分泌IFN的T细胞，并能抵抗相应病毒感染。
综上所述，对黏膜免疫佐剂及抗原呈递系统的免疫增强活性和作用机制的深入研究将会促进有效、安全、经济的黏膜疫苗的产生。
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