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标题: 核酸检测革命——可替代PCR的犀利技术：RPA [打印本页]

作者: wwwkkk83 时间: 2015-1-30 14:24
标题: 核酸检测革命——可替代PCR的犀利技术：RPA
自PCR技术诞生以来已经有三十年了，从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。很多人的实验根本离不开PCR。笔者曾经也接触PCR很长一段时间，加样、设置程序、等待、检测。这些过程看起来容易，但实验结果却总是会出人意料，很多时候根本不知道是哪里出了错。那么要是有一款技术，它比PCR更快速、便捷、高效，你会感兴趣吗？
RPA是什么？[attach]19[/attach]基本原理

重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。

重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

作者: wwwkkk83 时间: 2015-1-30 14:25
引物设计

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，用户需要自己摸条件进行优化。

优势

常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

据介绍，RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸（尤其是DNA）模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。

RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA，还省去了额外的cDNA合成步骤。你不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增过程进行实时监控，甚至可以通过试纸条（侧流层析试纸条LFD）读取结果。

作者: wwwkkk83 时间: 2015-1-30 14:25
RPA可以用来干什么？

RPA对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。以下为大家介绍RPA在细菌、病毒检测以及癌症研究等领域的应用情况。

RPA成为致病菌检测的得力工具

在今年发表的一系列文章中，RPA技术被广泛用于艰难梭状芽孢杆菌、结核杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA、淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、沙门氏菌、大肠埃希菌STEC等常见致病菌的检测。在临床诊断和食品安全方面，为人们提供了简单快速的实地筛查方案。（这篇文献之前网站报道过，在这里就不详述了。）[详细]

RPA技术建立沙眼衣原体快速检测方法

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）感染是最常见的性传播疾病之一。沙眼衣原体影响5-10%的人口，常见于小于25岁的成年人。目前广泛使用的沙眼衣原体检测方法是以聚合酶链反应（PCR）技术为基础，这种方法只适合于经过专业训练的人员在具有特定仪器的实验室使用。

日前，发表在《分子诊断杂志》（The Journal of Molecular Diagnostics）杂志上的一项研究中，研究人员利用RPA技术开发了一种检测沙眼衣原体的快速、灵敏的新方法，利用该方法在20分钟内即可得出检测结果。[参考文献]

研究人员利用RPA技术直接从患者尿液样本中检测沙眼衣原体，不需要从尿液样品提取总DNA，也不需要专门的仪器设备。而且该检测方法还具有少费力、少耗时、更经济等特点。与目前的沙眼衣原体检测方法比较而言，该方法还能够显著提高检测的敏感性和特异性

RPA检测疟原虫

澳大利亚科学家首次捕捉到疟原虫入侵并摧毁人体红细胞画面

核酸扩增是目前最灵敏的疟原虫（P. falciparum）特异性检测法。然而，PCR需要热循环设备和专业性操作，资源匮乏的地区往往难以满足这些条件。在这种情况下，与侧流层析结合的RPA有着很大的应用前景。

《Malaria Journal》杂志今年三月份发表的一项研究中，研究人员将RPA基础反应、TwistAmp nfo探针和侧流层析结合起来，实现了疟原虫18S rRNA基因的高灵敏度快速检测。在38°C的条件下，只需要不到十分钟的扩增，就能检出含有四个疟原虫的样本。加上侧流层析的检测时间，整个流程总共只需要15分钟，而且肉眼可以直接看到检测结果。

研究人员用不同疟原虫测试了这种方法的灵敏度和特异性。研究显示，所有疟原虫都被成功检出，所有非疟原虫都得出了阴性结果。文章指出，这一方案将大大改善资源匮乏地区的疟原虫分子诊断。

RPA检测冠状病毒

2012年在中东首次鉴定的中东呼吸综合症冠状病毒( Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)是一种新型的冠状病毒。这种病毒很快传入了欧洲，给公共安全机构敲响了警钟。

目前，MERS-CoV检测主要依赖于实时RT-PCR，需要收集患者样本然后到专门的实验室去检验。因此，亟需能够进行实地检测的快速装置。

《PLOS Currents：Outbreaks》去年十二月发表的一项研究，开发了一个能在3-7分钟内鉴定MERS-CoV的便携式RT-RPA装置。在42°C条件下，等温MERS-CoV RT-RPA与实时RT-PCR一样敏感，可检出10个RNA分子。文章指出，这个便携装置是监控MERS-CoV传播，寻找其动物宿主的理想方法。

RPA检测埃博拉等十种致命威胁

检测传染性疾病的综合panel，有助于资源匮乏地区进行实地分子诊断，对生物防御工作也有很大的帮助。

《Journal of Clinical Microbiology》杂志去年四月的一项研究开发了一个RPA检测panel，对土拉弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis）、鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、天花病毒进行RPA分析，对裂谷热病毒（Rift Valley fever virus）、埃博拉病毒、Sudan病毒和马尔堡病毒进行RT-RPA分析。研究显示，这些RPA和RT-RPA的分析灵敏度大多在16-21个分子之间（与实时PCR相当），42°C下只需运行6-10分钟，而且不存在交叉反应。

RPA检测HIV

在HIV诊治中，即时检测是非常重要的，对婴儿来说更是如此。有案例显示，HIV感染后立刻进行治疗就能控制住患者体内的病毒，让它们无法进行复制。举例来说，生来就携带HIV的密西西比婴儿，在出生后立即得到了治疗。后来这个孩子停药了两年多，病毒复制依然得到了控制。

目前婴儿HIV诊断的金标方法是DNA PCR，但许多地区并不具备这样的条件。在这种条件下，RPA技术正好可以大展身手
RPA在癌症研究中的应用

去年六月，新加坡A*STAR的研究团队在Lab on a Chip杂志上，发表了一种能够快速检测癌症单点突变的新技术，等温固相扩增/检测（ISAD）。这是一种无需标记的实时检测技术，将基于硅基微环（silicon microring）的固相扩增与等温重组酶聚合酶扩增（RPA）结合在一起。

去年十月，Talanta杂志上也发表了一项用到RPA技术的癌症研究。该研究在超灵敏生物条码分析（BBC）、适配体（aptamer）和RPA的基础上，开发了一个检测细胞色素C（Cyto-c）的新生物条码分析法（ABC）。细胞色素C是细胞死亡的重要标志物。

作者: wwwkkk83 时间: 2015-1-30 14:25
自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。

英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。

RPA技术犀利在何处

常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的最适温度在37°C - 42°C之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

据介绍，RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸（尤其是DNA）模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。

RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA，还省去了额外的cDNA合成步骤。你不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增过程进行实时监控，甚至可以通过试纸条（侧流层析试纸条LFD）读取结果。

目前，TwistAmp® 试剂盒的扩增子长度在500bp以内。不过，经过特别优化的RPA扩增，也可以生成更长的扩增产物，或者减慢扩增速度（便于定量），甚至在更低的温度下进行反应。

RPA技术的基本原理

RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。

ViaFect转染试剂

重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

RPA扩增的基础体系（TwistAmp® Basic）含有DNA扩增所需的所有试剂，我们只要准备好引物和模板就行。扩增结果可以通过凝胶电泳进行终点检测，产物纯化后可用于下游研究。

在这个基础体系中添入不同的酶和探针，就可以实现多样化的RPA应用。举例来说，TwistAmp® Basic RT添加了逆转录酶，可以对RNA模板进行一步法扩增。

TwistAmp® exo结合了专利的exo探针技术和核酸外切酶III，能实现数据的实时读取，就像荧光定量PCR一样。不过反应终点的扩增子总量有所减少，适合获得强荧光信号进行动力学分析，不适合终点检测（比如跑胶）。将exo探针技术、核酸外切酶III和逆转录酶结合起来的TwistAmp® exo RT，可以一步实现RNA模板的实时扩增。

TwistAmp® fpg是一个添加了核酶fpg的实时报告体系。fpg探针技术的荧光累积比较慢，但终点的扩增子产量不会减少，因此也能支持终点分析。TwistAmp® nfo加入了核酶nfo，可以用“三明治法”进行终点检测，比如测流层析试纸条LFD。

除此之外，RPA扩增还可以很简单的实现多重化。只需要增加引物/探针就可以一次性检测多个扩增产物。

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。

在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，用户需要自己摸条件进行优化。虽然还没有设计软件可以使用，不过TwistDx Inc公司在自己的网站上提供了相应的筛选指南。

需要注意的是，目前的TwistAmp® 扩增试剂盒都没提供RNase抑制剂。另外，受目前的生产方法所限，RPA反应不适合用于E. coli标准实验室菌株的扩增。

作者: wwwkkk83 时间: 2015-1-30 14:26
RPA反应需要在怎样的温度下进行?

标准TwistAmp®试剂盒的运行温度在37°C - 42°C之间。温度超过42°C会使酶的活性受到影响。RPA反应在低于37°C的条件下也能进行，不过TwistAmp®试剂盒已经针对反应速度进行了优化，不一定支持超出范围的温度条件。为了获得更好的效果，TwistDx公司推荐用户在40°C下使用于逆转录试剂盒。

RPA反应能实现多重化么?

可以。RPA技术支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要精心设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，RPA反应的引物总量(nmol)最好不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。另外，我们应当事先考虑好检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光团的兼容性。

RPA反应需要在特殊仪器上进行么?

不需要。对TwistAmp®基础试剂盒和nfo试剂盒而言，只要温度能控制在37-42°C之间就行。进行实时监控的体系(如TwistAmp® exo试剂盒)，需要能够激发和检测荧光团的恒温装置，比如酶标仪或实时检测的热循环仪。

RPA反应能对模板进行定量么?

可以。扩增子达到可检出水平的时间，依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，扩增子就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，确保对照反应是同时开始的。举例来说，可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系，RPA反应就会开始。

此外，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。

扩增产物能在琼脂糖凝胶上分析么?

可以，TwistAmp®基础反应、TwistAmp®nfo和TwistAmp® fpg都可以通过跑胶进行终点分析。不过TwistAmp® exo不行，因为该系统里的外切核酸酶会消化扩增子。

扩增反应能进行荧光终点分析么?

可以。这样比较的是反应开始时的荧光和反应结束时的荧光，荧光增强意味着发生了扩增。

RPA支持生物素或荧光标记的寡核苷酸么?

支持。在RPA反应中，连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。据悉还没有发现任何差异。

能用插入性染料实时监控RPA么?

可以。插入性染料可以在RPA反应中进行定量和监控。不过，这种染料可以结合任何双链DNA，会生成来自引物的假阳性信号。由于RPA扩增在常温下进行，这种噪音会比PCR严重一些。此外，不推荐把插入性染料用于TwistAmp® exo体系，因为体系中的核酸外切酶会在反应过程中切割扩增产物。

RPA试剂能制成master-mix么?

可以。在进行DNA检测时，可以把重悬缓冲液、引物和探针混合在一起，重悬冻干的RPA pellets。然后将不同DNA加入反应体系，最后用MgAc起始反应。在进行引物筛选时，可以用重悬缓冲液、模板DNA、探针和一个引物制成master-mix，将其分装到1.5 ml小管之后再分别加入不同的引物。注意：只有当两个引物都存在时，才能重悬冻干的RPA pellets，否则重组过程就会有偏向性。

跑胶之前需要回收RPA产物么?

需要。RPA反应中的物质会干扰琼脂糖电泳，如果不进行产物回收，跑出来的带会出现拖尾。

RPA反应的扩增子能保存么?

TwistAmp® Basic或nfo的扩增产物可以保存，短期可以放在4°C，保存时间较长的话建议放在-20°C。

TwistAmp® exo (RT)的扩增产物不能保存。因为扩增停止后如果没有及时失活，外切酶III会快速消化扩增子。

TwistAmp® 基础反应的扩增子能进行TA克隆么?

TwistAmp®基础反应中的聚合酶没有编辑功能，扩增子应该是可以用于TA克隆的。不过TwistDx公司还没有针对这项应用进行过测试。

能直接用标记的探针和TwistAmp®基础试剂盒进行侧流层析检测么?

可以。你可以用两个经过修饰的引物来进行侧流层析检测(LFD)。不过TwistDx公司推荐使用探针和TwistAmp® nfo 试剂盒。这是因为RPA跟PCR差不多，也倾向于形成引物二聚体。如果引物不完美，很容易发生交叉反应，生成假阳性结果。而TwistAmp® nfo体系能够避免这个问题。

在用侧流层析试纸进行检测时需要稀释RPA产物么?

是的。RPA反应中的一些物质会干扰试纸上的抗体，如果不能充分稀释就会出现非特异性结合和假阳性信号。

在TwistAmp® exo (RT)反应即将结束时荧光急剧增强，这正常么?

是正常的。在TwistAmp® exo反应中，聚合酶和核酸外切酶III处于竞争关系。随着反应的能量逐渐耗尽，核酸外切酶III开始占据优势，结果导致荧光信号出现剧增。

作者: wwwkkk83 时间: 2015-1-30 14:26
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司TwistDx Inc开发）。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

RPA检测疟原虫核酸扩增是目前最灵敏的疟原虫（P. falciparum）特异性检测法。然而，PCR需要热循环设备和专业性操作，资源匮乏的地区往往难以满足这些条件。在这种情况下，与侧流层析结合的RPA有着很大的应用前景。

《Malaria Journal》杂志今年三月份发表的一项研究中，研究人员将RPA基础反应、TwistAmp nfo探针和侧流层析结合起来，实现了疟原虫18S rRNA基因的高灵敏度快速检测。在38°C的条件下，只需要不到十分钟的扩增，就能检出含有四个疟原虫的样本。加上侧流层析的检测时间，整个流程总共只需要15分钟，而且肉眼可以直接看到检测结果。

研究人员用不同疟原虫测试了这种方法的灵敏度和特异性。研究显示，所有疟原虫都被成功检出，所有非疟原虫都得出了阴性结果。文章指出，这一方案将大大改善资源匮乏地区的疟原虫分子诊断。

RPA检测埃博拉等十种致命威胁检测传染性疾病的综合panel，有助于资源匮乏地区进行实地分子诊断，对生物防御工作也有很大的帮助。

《Journal of Clinical Microbiology》杂志去年四月的一项研究开发了一个RPA检测panel，对土拉弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis）、鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）、天花病毒进行RPA分析，对裂谷热病毒（Rift Valley fever virus）、埃博拉病毒、Sudan病毒和马尔堡病毒进行RT-RPA分析。研究显示，这些RPA和RT-RPA的分析灵敏度大多在16-21个分子之间（与实时PCR相当），42°C下只需运行6-10分钟，而且不存在交叉反应。

RPA检测冠状病毒2012年在中东首次鉴定的中东呼吸综合症冠状病毒( Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)是一种新型的冠状病毒。这种病毒很快传入了欧洲，给公共安全机构敲响了警钟。

目前，MERS-CoV检测主要依赖于实时RT-PCR，需要收集患者样本然后到专门的实验室去检验。因此，亟需能够进行实地检测的快速装置。

《PLOS Currents：Outbreaks》去年十二月发表的一项研究，开发了一个能在3-7分钟内鉴定MERS-CoV的便携式RT-RPA装置。在42°C条件下，等温MERS-CoV RT-RPA与实时RT-PCR一样敏感，可检出10个RNA分子。文章指出，这个便携装置是监控MERS-CoV传播，寻找其动物宿主的理想方法。

除此之外，世界各地的研究者们近期还用RPA技术检测了许多其他的病毒。比如南美对虾浓核症病毒、对虾白斑综合症病毒、李痘病毒、樱桃小果病毒2、黄热病毒、牛冠状病毒、施马伦贝格病毒、牛病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒等等。RPA甚至还被用来直接检验尿液中的沙眼衣原体。

作者: wwwkkk83 时间: 2015-1-30 14:27
在HIV诊治中，即时检测是非常重要的，对婴儿来说更是如此。有案例显示，HIV感染后立刻进行治疗就能控制住患者体内的病毒，让它们无法进行复制。举例来说，生来就携带HIV的密西西比婴儿，在出生后立即得到了治疗。后来这个孩子停药了两年多，病毒复制依然得到了控制。

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目前婴儿HIV诊断的金标方法是DNA PCR，但许多地区并不具备这样的条件。在这种条件下，RPA技术正好可以大展身手。

纸做的HIV DNA检测装置

2012年九月，研究人员开发了一个由纸、玻璃纤维和塑料制成的装置，用来对HIV的DNA进行RPA扩增。这个装置成本低、小巧轻便、而且易于使用，只需五步就能搞定HIV检测。扩增结果可以通过侧流层析试纸来读取。

人们可以先从婴儿的干血斑样本中提取DNA，然后再进行RPA扩增。研究显示，用这个装置进行RPA扩增反应，能在十五分钟内将10拷贝的HIV DNA扩增到可检出的水平。可见，这是一个前景广阔的低成本即时检测装置。

RPA检测HIV DNA的实战效果

如果不能及时检测婴儿体内的HIV-1，就会延误治疗并影响治疗效果。2013年的一项研究设计了靶标HIV-1基因组不同区域（长末端重复LTR和pol）的两种探针。研究人员用这两个探针分别进行RPA扩增，然后进行荧光检测和侧流层析试纸检测。研究表明，这样的方法能够可靠地检测到3拷贝的前病毒DNA。研究人员在此基础上测试了多个HIV-1突变株，pol和LTR引物的扩增率分别为98.6%和93%。

这是一个能检测出HIV-1所有主要亚型的等温扩增法，能够在资源匮乏的地区帮助人们诊断携带被HIV感染的婴儿。

文献来源：Rapid detection of HIV-1 proviral DNA for early infant diagnosis using recombinase polymerase amplification.

HIV DNA的实时定量检测

今年五月，研究人员使用内参和标准曲线，通过RPA扩增定量了HIV-1 DNA的浓度。这是一种基于实时荧光数据的定量RPA技术，被称为qRPA。

这项研究通过一系列试验，分析和定量了不同浓度的HIV-1 DNA样本。研究显示，在所有测试的浓度范围内，qRPA的预测值与正确值在一个数量级以内。可见，定量RPA（TwistAmp exo）可以作为核酸定量的有力工具，用于即时检测和体外诊断。

文献来源：Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification, Analytical Chemistry

不插电的HIV DNA检测

绝大多数核酸扩增（包括等温扩增）都需要电。但在资源匮乏的区域，最好是有不需要持续供电的诊断工具。RPA的工作温度在25-43°C之间，不需要严格控制孵育温度，就能达到理想的性能。

今年九月的一项研究显示，当室温在31°C - 43°C之间时，孵育20分钟RPA反应就能成功进行，检测到10拷贝的HIV-1前病毒DNA。

当室温降到30°C以下时，RPA的扩增性能有所下降。为此，研究人员开发了一个简单的化学加热器，在室温10-30°C时孵育HIV-1 RPA反应。研究显示，RPA的性能通过加热孵育得到了恢复，能检测到10拷贝的HIV-1前病毒DNA。

研究人员在15°C、20°C、25°C和30°C，用这种加热器进行了12个RPA反应，结果全部扩增成功。他们还发现，当温度较低时，孵育30分钟能促进RPA的扩增性能。研究表明，对RPA HIV-1反应进行化学加热，与电力设备效果差不多。这也说明，RPA HIV-1检测不需要多好的设备，就可以实现高灵敏度的诊断。

文献来源：Non-Instrumented Incubation of a Recombinase Polymerase Amplification Assay for the Rapid and Sensitive Detection of Proviral HIV-1 DNA.

作者: wwwkkk83 时间: 2015-1-31 13:53
RPA用于癌症突变检测

新加坡A*STAR的研究团队去年六月在Lab on a Chip杂志上，发表了一种能够快速检测癌症单点突变的新技术，等温固相扩增/检测（ISAD）。这是一种无需标记的实时检测技术，将基于硅基微环（silicon microring）的固相扩增与等温重组酶聚合酶扩增（RPA）结合在一起。

在这项研究中，ISAD主要用于检测HRAS（Harvey RAS）基因的单点突变。在固相扩增阶段，引物直接连在设备的表面。在扩增过程中，硅基微环谐振器会发生光的波长漂移，在此基础上就能对扩增DNA进行检测，不需要任何标记。

研究显示，与RPA和传统PCR方法相比，ISAD技术的灵敏度要高一百倍。这个技术能够在扩增过程中区分HRAS基因的一个单点突变。由此可见，ISAD能够用于突变、单核苷段多态性和癌症指标的检测。

RPA用于抗癌药物筛选

去年十月，Talanta杂志上也发表了一项用到RPA技术的癌症研究。该研究在超灵敏生物条码分析（BBC）、适配体（aptamer）和RPA的基础上，开发了一个检测细胞色素C（Cyto-c）的新生物条码分析法（ABC）。细胞色素C是细胞死亡的重要标志物。

适配体是一种单链短DNA，它折叠形成的3D结构能够结合特定的目标分子，具有高亲和力和特异性。

研究人员在BBC分析的基础上进行优化，采用了Cyto-c特异性的适配子，并用等温重组酶聚合酶扩增（RPA）替代了耗时长的PCR。研究显示，ABC分析的检出限低至10 ng/mL，而且可以在三小时内完成。研究人员用ABC方法对一些潜在的抗癌药物进行了体外测试，检验了它们对不耐药和多重耐药性肝癌的杀伤效果。

作者: wwwkkk83 时间: 2015-1-31 13:56
RPA在二代测序中的应用

   大规模并行测序技术（即二代测序NGS）是基因组和遗传学领域的一次技术革命。NGS自诞生以来，不论是测序规模还是测序效率都有了飞速的提升。尽管这一技术已经取得了巨大的成功，但有着极端碱基组成的基因组区域，对于目前的NGS平台来说仍然是一个很大的挑战。

   不少重要的病原体都具有极端的碱基组成，比如疟原虫（高AT含量）和结核杆菌（高GC含量）。PCR扩增是标准的文库制备程序，不过PCR会导致不均匀的读取覆盖度（特别是在富含AT和GC的区域），最终影响基因组的装配和变异分析。而省却PCR扩增的文库制备方案，需要大量的初始材料，不适合处理从临床上分离的样本。

   为此，Wellcome Trust Sanger 研究所的研究团队对测序文库的制备进行了优化，找到了既适合低量样本又耐受高AT含量的文库制备方案。这项研究发表在2012年的BMC Genomics杂志上。

   研究人员用非临床和临床分离物（含大约53%的宿主污染物）制备Illumina测序文库，分别使用了不同的聚合酶、PCR和RPA方法，并对测序结果进行了分析和比较。他们在此基础上增强了高AT含量区域的测序覆盖度，减少了极端碱基组成带来的偏向性。

   这项研究的RPA等温扩增直接使用了TwistAmp基础反应，没有进行任何优化。结果显示，RPA制备测序文库时产量相对较高，与标准Illumina文库制备相比，对极端碱基组成的模板偏向性较少，覆盖度有一定的提升。不过测序后的嵌合和重复读取（chimeric and duplicate reads）相对较多。

作者: 序道 时间: 2015-2-1 14:28
楼主能不能把相关内容的文献也附在当中的话会更好不过多谢楼主的挖掘，这技术挺好的，回头得好好看看啦

作者: 孟钱钱 时间: 2015-11-28 09:54
很好很强大！！！

作者: cmo 时间: 2015-12-1 15:16
附上一篇中文综述，希望有用。

作者: wangbingyu 时间: 2017-3-12 21:44
反应体系供能。最终产物合成的误差有多大?影响酶反应体系的因素有哪些?

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