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标题: [转移帖]疫苗的分离纯化技术与研究进展 [打印本页]

作者: zhaox 时间: 2015-12-2 15:01
标题: [转移帖]疫苗的分离纯化技术与研究进展
原帖由论坛会员Rojjer发表于 2008-3-8 09:16 |

人们通过以下两个方向的研究以期得到具有更高纯度、无菌性和安全性的疫苗制品：⑴  提高疫苗的分离纯化工艺水平；⑵  研制更高效、更安全的新疫苗。

      近几十年来，化学、生物化学、分子生物学和免疫学等学科的空前发展，尤其是基因工程技术的兴起，使得人们可直接从细菌或病毒中提纯有效的蛋白（或多糖）抗原成分制成无细胞疫苗；可通过克隆外源基因到细菌和病毒中，或者突变、缺失有关基因获得基因工程减毒活疫苗；也可通过克隆外源基因到细菌、酵母、动植物及昆虫细胞中表达病原菌的特异性蛋白抗原制成基因工程亚单位疫苗。20世纪90年代后期出现的核酸疫苗则为预防一些长期以来无法预防或预防效果不佳的传染病带来曙光。

      传统疫苗的处理方法远不能满足这些新疫苗研制和生产的需要。疫苗分离纯化研究方兴未艾，国内外关于疫苗及其分离纯化的论文和专利也相应逐年递增。目前，通过FDA认证的疫苗已有上百种，而正在研制开发中的疫苗达数千种之多，有关疫苗研究的科学论文和专利几乎都涉及到分离纯化技术，近年来这类文献呈现指数增长态势。

      除部分多糖疫苗（或多糖结合疫苗）和核酸疫苗外，目前广泛使用和研发的疫苗（尤其是基因工程疫苗）本质上多为蛋白质，具备一般蛋白质的性质，因而其分离纯化与蛋白质的分离纯化具有相同之处。但与一般蛋白质相比，疫苗的普及率高、用量大，且使用对象多为婴幼儿和儿童，其分离纯化相应要求更高；很多疫苗（如乙肝表面抗原）由多聚亚基组成，其免疫原性大于各单个亚基免疫原性之和，分离纯化过程更为复杂；蛋白疫苗和一般基因工程蛋白的最大不同在于其分子量往往高达几十万甚至数百万道尔顿。因而，疫苗的分离纯化和一般蛋白相比又具有不同之处。

      无论是传统疫苗还是新疫苗，彼此之间在研制方式、组成成分和物理、化学性质及原始来源等诸多方面都存在或大或小的差异，其分离纯化方法具有相对特殊性。针对不同的疫苗制品应选用不同的分离纯化路线，但一般而言，都包括两个基本阶段：初级分离和精制纯化。初级分离阶段的主要任务是分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物（如果产物在细胞内），浓缩产物和去除大部分杂质等，这一阶段可选用的分离方法包括细胞破碎技术、离心沉降和各种沉淀方法等，精制纯化阶段则选用各种具有高分辨率的技术以使产物和少量干扰杂质尽可能分开，达到所需的质量标准，超速离心技术和各种层析技术成为当前达到此目的的主要方法。

      传统疫苗的分离纯化方法

      灭活疫苗或减毒疫苗来源于经减毒或灭活工艺而得的活病原体，或者从被感染的病原体中分离得到的不具传染性的病毒颗粒。这种疫苗由全颗粒菌体或病毒组成，其纯制过程相对于一些亚单位疫苗、基因工程疫苗的生产工艺要简单许多，主要在于去除病毒核酸和杂蛋白，一般只涉及简单分离，早期大多采取连续离心、沉淀、过滤或萃取等物理、化学方法提纯。我国采用酸沉淀法生产百日咳灭活疫苗，就是由菌体培养液加甲醛杀菌灭活后，用HCl调pH至3.8~4.4，静置十几小时自然沉淀出菌体和可溶性抗原，再离心、洗涤而得。

      由于具有操作简单、工艺经济且易于放大等特点以及有一定的安全性记录，连续离心法、沉淀和过滤技术在疫苗的分离中仍被普遍采用，但绝大部分由简单分离得到的粗制疫苗中抗原含量较低，且可能含有一些杂质和过敏性物质，一般均存在纯度、活力以及安全性偏低等缺点，难以再通过药物管理机构的批准，因此有必要进行疫苗的进一步精制纯化。为解决这类问题，蔗糖(垫)、CsCl、KBr等梯度离心和高速、超速甚至超高速离心得以利用。此外，差速梯度离心技术也很有应用价值，Karalus  采用此技术纯化嗜血流感细菌(Haemophilus  influenzae)外膜脂蛋白P6，先连续离心(9000g)收获菌体超声破碎，再高速离心(21000g)沉淀出肽聚糖和含有P6的未破碎细胞，最后超速离心(100000g)除去肽聚糖，加压透析得到目的抗原组分。沉淀技术方面，除(NH4)2SO4、酸、醇和聚乙二醇(PEG)等继续应用外，近年来微分硫酸铵沉降  (differential  ammonium  sulfate  precipitation)  技术也应用于疫苗的研制中。

      为获得免疫原性好、保护性强、毒副作用小的疫苗，早期的纯化工艺依据物质的分子量、密度和表面电荷的不同来分离疫苗，往往以密度梯度离心为主，辅之以超滤、沉淀等技术，如我国乙肝表面抗原和狂犬病疫苗的生产。用该工艺制备的疫苗纯度和性状能符合要求，但抗原回收率不高、操作繁琐且周期长、技术设备要求高，近年来已逐渐为日臻成熟的层析技术所代替，在基因工程疫苗的研制中尤为如此。传统的离心、过滤和沉淀技术更多只是作为整个疫苗分离纯化工艺的起始步骤，用于初步分离过程，层析技术与沉淀、离心等传统分离技术的结合已逐渐成为疫苗分离纯化的主流。

作者: zhaox 时间: 2015-12-2 15:01
zhangning发表于 2008-3-8 11:41 |

学习过！层析技术与沉淀、离心等传统分离技术的结合已逐渐成为疫苗分离纯化的主流。大家一起努力！

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