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标题: [转移帖]收集整理PEG 沉淀提纯病毒方法 [打印本页]

作者: zhaox 时间: 2015-12-5 18:57
标题: [转移帖]收集整理PEG 沉淀提纯病毒方法
本帖最后由 zhaox 于 2015-12-5 19:01 编辑

原帖由论坛会员pipi302发表于 2009-9-25 19:03 |

从网上搜索到得关于PEG沉淀提纯病毒的方法，先汇总至此贴，希望大家支持本版
1、用超声波或冻融的方法使细胞破碎释放出病毒；
2、慢慢搅动并加入NaCl终浓度是0.5mol/L,有助于病毒的沉淀，再等量加入10％PEG(一般使用的是PEG6000就可以了。如果对样品的纯度不是严格要求的话，可以建议使用Millpore公司的离心浓缩柱，Amicon系列的可以一次浓缩15ml样品。)；
3、4℃过夜或放置一段时间；
4、8000/min离心30分钟，收集病毒沉淀；
5、将病毒沉淀加入适量的pbs中，4℃过夜；
6、10000r/min离心1小时,沉淀即为浓缩的病毒。
还可以用梯度离心或其他方法进一步纯化。

聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)( Polyethylene Glycol 简写为 PEG)，它的亲水性强，溶于水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的 PEG。
PEG 的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液pH 和温度等因素的影响。在一定的pH 值下，盐浓度越高，所需PEG 的浓度越低，溶液的pH 越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG 的浓度越低。在一定范围内，高分子量和高浓度的PEG 沉淀的效率高。以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，其解释主要有：①认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。
有机聚合物沉淀的优点是：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性；②沉淀效能高，使用很少量的PEG 即可以沉淀相当多的生物大分子；③沉淀后有机聚合物容易去除。
水溶性非离子型聚合物沉淀法常用的聚合物为聚乙二醇（PEG）及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白质的机制尚不清楚，大致有如下解释：①聚合物与蛋白质形成共沉物；①聚合物与蛋白质之间发生水的重分配；①聚合物与蛋白质形成复合物。此法受许多因素影响，主要是pH、离子强度、蛋白质浓度和PEG的分子量等。分子量为 2000～6000的PEG皆适宜于做蛋白沉淀用。如若使用得当，效果甚为满意。一般认为，PEG浓度在3％～4％时沉淀免疫复合物，6％～7％可沉淀 IgM，8％～12％可沉淀IgG，12％～15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。最突出的应用是用3％～4％的PEG沉淀免疫复合物，未结合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速测定法和循环免疫复合物测定法

作者: zhaox 时间: 2015-12-5 18:58
pipi302发表于 2009-9-25 19:04 |:

1.收获的病毒感染细胞悬液冻融3次，经10 000rpm离心30min，沉淀悬浮于1/10原体积匀浆介质中(10 mmol/L Tris-HC1，pH8.0， 250 mmol/L NaCl)，于-20℃保存；
2. 上清液加入PEG6000，终浓度8%，4℃过夜，20 000rpm离心45 m in，沉淀物悬浮于1/50原体积匀浆介质中，在上述沉淀物和PEG沉淀中分别加入2-琉基乙醇( 2-marcap-toethanol)，终浓度为 10mmol/L，研磨后加入a-胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin) 25 ug/ml，室温消化1h，再加入去氧胆酸钠(sodium deoxycholate) 500ug/ml，0℃冰浴1 h，30 000rpm离心15min，吸取上清液，加入等体积氯仿，混匀2min, 30 000rpm离心15min，吸取含病毒的上层水相，辅加在CSCl线性梯度上(p= 1.18-1.40), 110 000rpm离心2 h(Beckman SW 28 Rotor)。分部收集，合并含病毒峰，用CSCl液稀释合并液(p= 1. 37), 130 000rpm离心19 h。分部收集，合并含病毒峰管，用无菌水稀释后139 000rpm离心1. 5 h，病毒沉淀悬于小体积无菌水中。

作者: zhaox 时间: 2015-12-5 19:00
pipo302发表于 2009-9-25 19:04 | :

1. Viruses such as baculovirus can be concentrated by polyethylene glycol precipitation.
2. Adjust the pH of the virus-containing supernatant to 7.2-7.5. Polyethylene glycol (PEG, MW 6,000) is added to a final concentration of 8% (w/v).
3. Stir at 4℃for 2 hours.
4. Centrifuge at 10,000 x g for 2 hours.
5. Resuspend the pellet in a small volume of appropriate buffer ( e.g., RNase-free ddH2 for virus RNA prep).

作者: zhaox 时间: 2015-12-5 19:02
pipi302发表于 2009-9-25 19:04 |:

沉淀法-病毒提纯方法
主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。
　1.中性盐沉淀法：病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。　
　2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 000～6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年) 成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。
3.有机溶剂沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。
　4.等电点沉淀法：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。多数病毒的等电点在pH4.5～5.5之间，因此在pH3～6范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。
　5.皂土法：Girin(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH4～4.5)吸附轮状病毒SA-11，再在碱性条件下（pH8.5），又使其洗脱下来，从而达到纯化目的。
6.鱼精蛋白沉淀法：鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/LNaCl时，病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。

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