人类狂犬病疫苗的发展历程：从脑内传代至适应细胞 - 中国病毒学论坛|我们一直在坚持！

[摘要] 全球狂犬病预防控制的一个主要问题就是缺乏足量、价廉、高质量的狂犬病疫苗。此类候选疫苗应纯净、高效、安全，能有效和经济地进行生产，能广泛适用于具有重要流行病学意义的病毒变异株。回顾获准注册的人用疫苗的历史，清晰显示了此领域是如何演变为目前的状态：发展更被动，主要依赖暴露后处置。现代细胞培养技术提供了适当的病毒基质可以用于代表性的经验证的病毒种子的生产。相比于过时的基于神经组织的狂犬病疫苗，一旦鉴定出一种合适的基质，高滴度病毒的生产将会产生一个质和量上的飞跃。考虑到目前人用疫苗仅使用灭活疫苗，高度适应细胞的稳定的减毒狂犬病疫苗将是未来符合种子批病毒要求的理想疫苗。

在经匀浆的组织悬液中，只有狂犬病毒抗原可以提供针对抗狂犬病的保护。目前，向人体注射大量未纯化的动物组织，被看作是预防狂犬病所不能接受的、绝望的办法。相比之下，早在20世纪30年代脊髓灰质炎病毒就已经经过纯化、浓缩用于免疫学研究[35]。细胞培养和现代工业发酵技术的进步已经从根本上增进了生产高质量疫苗的能力，使易感人群大规模免疫接种成为可能。组织来源的狂犬病疫苗利用神经组织或整个禽类胚胎作为基质，未达到目前药品生产质量管理规范（GMP）的要求，也完全不符合目前的纯化标准。

早期体外细胞培养的实验尝试开始于19世纪80年代，该技术建立于20世纪50、60年代（图1）。1954年的诺贝尔奖授予脊髓灰质炎病毒在细胞培养中的突破性进展[36–38]，当时细胞来源的狂犬病疫苗的研究仅仅处在起始阶段[39]。类似于狂犬病毒，脊髓灰质炎病毒也是高度嗜神经组织的。然而，体外细胞培养之后，脊髓灰质炎病毒失去了趋向性，可以在多种不同类型细胞增殖[36,37]。几年后，在狂犬病毒也发现此种现象。

原代地鼠肾细胞(PHKCV)是第一株被批准的细胞培养人用狂犬病毒疫苗，但其影响力和应用都是有限的。狂犬病毒街毒株和固定毒株，譬如标准攻击毒(CVS)，于1958年在原代地鼠肾细胞培养[40]。随后，利用此技术生产出实验室疫苗株[41,42]。原代地鼠肾细胞也可以作为检测灭活组织疫苗中残余存活狂犬病毒的敏感基质[43]。1968年，加拿大批准使用狂犬病毒固定毒株CL-60（来源于阿拉巴马州达弗林街[SAD]分离株）的原代地鼠肾细胞疫苗[44]。自1971年起，前苏联使用Vnukovo-32毒株（SAD毒株在原代地鼠肾细胞适应后的衍生株）生产原代地鼠肾细胞疫苗[44]。1980年，中国批准吸附磷酸铝冻干的原代地鼠肾细胞疫苗[45,46]。此外，1974年研发出使用巴斯德毒株(PV株)的胎牛肾细胞狂犬病毒疫苗[44]，1978年研发出使用Pitman– Moore株(PM株)的狗肾细胞的狂犬病毒疫苗。荷兰批准了上述两株疫苗[44]。

第一株人二倍体细胞株(HDC)WI-38，建立于1961年（图1）。此后不久，狂犬病毒CVS-24在WI-38细胞内增殖，观察到不同的致细胞病变效应[47,48]。在成功制备出人类脊髓灰质炎试验用疫苗之后，试图维持狂犬病毒在WI-38细胞生长的计划意外失败[49,50]。约2年后，通过调整和修改感染过程，狂犬病毒PV株、PM株、HEP株和 LEP株在人二倍体细胞中能成功持续感染[51]。尽管人二倍体细胞具有上述优于体外原代细胞的长处，接受WI-38细胞作为疫苗基质仍是一条漫长而艰辛的道路，正如发明人所述：“发现人二倍体细胞株的整个历史就是一连串的失败、失望、误解及最终的法律诉讼”[48]。具有讽刺意味的是，1972年，美国监管机构批准Hayfick的WI-38细胞用于脊髓灰质炎疫苗生产[52]。在此项批准前，狂犬病毒人二倍体细胞疫苗(HDCV)的继续研究转向了MRC-5细胞－在欧洲开发的一种类似的胎儿肺细胞株[53]。1974年12月法国批准狂犬病毒人二倍体细胞疫苗(HDCV)，随后，美国在1980年6月也批准了该疫苗[54]。狂犬病毒HDCV是第一株纯化、浓缩和冻干的无任何佐剂的狂犬病疫苗，含有人血白蛋白作为稳定剂。尔后，狂犬病毒HDCV被WHO推荐为金标准参考疫苗。与其他狂犬病疫苗相比，狂犬病毒HDCV较少引起不良反应。迄今为止，仅有极个别的短暂的神经性麻痹疾病案例[54,55] 可能与接种HDCV有某种相关性。从一开始，生产HDCV证明难以规模化生产以满足工业化需求。所以，HDCV成本仍然很高，典型地仅适用于发达国家。

一种浓缩吸附狂犬病疫苗(RVA)可能是唯一在美国开发并专有使用的狂犬病疫苗。相比于HDCV冗长复杂的批准过程，1982年RVA在FRhL-2细胞（美国菌种保藏中心[ATCC] CL160，恒河猴胎肺细胞）由密歇根公共卫生部研究开发，1988年审批通过[56,57]。RVA使用Kissling CVS病毒株，（此病毒株背景起源尚不清楚，但一般认为CVS由PV株派生），吸附于磷酸铝（AlPO4），保持液态。尽管得到批准，RVA在美国市场上不再有供应。有趣的是，使用PM株、基于人二倍体细胞的RVA经重新开发，于2002年在印度通过审批供人类使用[17]。

二倍体细胞株，包括WI-38、MRC-5 和 FRhL-2，分裂能力有限（有限寿命是连续约50次传代），之后细胞衰老，这种现象称为“海弗利克（Hayfick）极限”。此外，二倍体细胞株很难大规模工业培养用于疫苗生产。永生细胞系具有无限生长能力，并且易于大规模培养用于工业生产，但可能被认为具有致癌性。理论上讲，体内癌症发生可能由于引入单个细胞或功能性的致癌转录单元插入正常的体细胞染色体。将此细胞株用于疫苗生产需要谨慎考虑。第一株细胞系HeLa建立于1951年（图1）。随后开发的其他细胞系已经用于许多感染性疾病研究。感染狂犬病毒CVS株、HEP株、LEP株和PM株的幼地鼠肾(BHK-21)细胞产生细胞病变效应[50,64]。

Vero细胞系来源于非洲绿猴肾细胞，于1962年建立（图1）。Vero细胞支持数个狂犬病毒属的感染，包括HEP株、CVS株、Lagos 蝙蝠病毒、Mokola病毒和Duvenhage蝙蝠病毒。在1978年，美国监管当局接受连续传代细胞系用于人用生物制品的生产[52]。在20世纪70年代晚期和80年代早期，以Vero细胞为基质生产商业用灭活脊髓灰质炎疫苗[68]。在20世纪80年代早期，研发Vero细胞为基质生产狂犬病疫苗[69–71]。1985年欧洲批准纯化的Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV) [44]。Vero细胞在工业发酵中易于大规模放大培养（6000L以上）。目前，Vero细胞狂犬病疫苗已经在全球范围内广泛使用，但是在美国还未获得批准。

表1列出了狂犬病毒在人类疫苗中的应用范例。由于目前人用狂犬病疫苗都是灭活的，理论上讲，任何狂犬病毒株都可以用来制备疫苗。实际上，现代人用狂犬病疫苗必须要经过浓缩和纯化，浓缩和纯化大量强毒株的过程对于生产者来说构成严重生物安全问题。这样的狂犬病案例也确实曾发生在一个实验室工作人员身上，当他在制备试验用动物口服狂犬病疫苗的时候[72]。此外，与减毒株相比，强毒株通常只有较低的病毒产量。总而言之，历史上这三个狂犬病毒株已在体内和体外完全适应，并且成为生产人用狂犬病疫苗的主要候选株：巴斯德毒株（PAS）及其衍生株；Flury及其衍生株；SAD株及其衍生株。

最古老的狂犬病毒疫苗株PAS于1882年分离[2]。为制备神经组织疫苗（NTV），此病毒株只在兔细胞传代。随后泛美人兽共患病中心出现著名的PV株，虽然没有文件记载的确切来源，但可能来源于PAS株[73]。动物研究中使用的标准攻毒株CVS来源于PV株。此外，普遍认为PM株也来源于PAS株。PV-2061株，更准确的说PAS-2061株，是PV株 (或PAS株) 在兔脑传至2061代，之后在Vero细胞适应传至19代，再转向BSR细胞（BHK-21的克隆）传代5次[73]。PAS株及其衍生株已经用于大量人用狂犬病疫苗制备，不包括原代地鼠肾细胞疫苗（PHKCV）和纯化鸡胚细胞疫苗（PCECV）。然而，PV株 (或PAS株)及其衍生株的残余毒力仍然是个严重的生物安全问题。Fermi疫苗使用PV株，1960年在巴西的一次事故中直接导致至少18人患狂犬病死亡[74]。

Flury狂犬病毒株于1939年在美国乔治亚州分离，在鸡胚细胞上传代减毒。LEP病毒株和HEP病毒株的开发原本是期望能代替NTVs，但使用全鸡胚开发出人用狂犬疫苗的尝试最终失败了。随后开发的纯化鸡胚细胞疫苗使用的LEP-c25病毒株是来源于兽用疫苗株LEP-c23（见PCECV一节）。

SAD病毒株于1935年在美国（阿拉巴马州）分离。其衍生株CL-60和Vnukovo-32已经在加拿大和俄罗斯用于原代地鼠肾细胞疫苗的制备。许多SAD的减毒衍生株，例如Evelyn-Rokitnicki-Abelseth株(ERA), SAD-B19株, SAG-1株和 SAG-2株，已经广泛用在狂犬病减毒活疫苗中，用于野生动物的口服免疫，或狗和其他动物的注射免疫接种[75–77]。希望此类近期的SAD减毒衍生株，例如LEP-c25，在未来能够进一步开发用作人用狂犬病疫苗。

早期尝试使用LEP和HEP鸡胚疫苗的失败部分刺激了20世纪60年代Fuenzalida/Palacios疫苗的开发。最初禽类胚胎疫苗的低效力可能是由于哺乳动物的病毒不能很好适应禽类胚胎，最终导致病毒产量不足。然而，20世纪80年代适应鸡胚成纤维细胞之后，用LEP-c25和HEP成功研制出纯化鸡胚细胞疫苗，质量可以与HDCV媲美。其他先前的脑组织适应的狂犬病毒，包括PAS、PV和SAD株，可以适应多种细胞系。衍生病毒株在细胞传代后重新命名，例如PM, PM-WI-38-1503-3M, PM-1503-3M, PM-1503, Kissling株, CVS-11 Kissling株, Vnukovo-32和PV-2061株，给他们的出处蒙上了神秘、令人困惑的面纱。譬如，PM 株(来源于PAS株或PV株)已经被引用为PM, PM-1503, PM-1503-3M或是PM-WI-38-1503-3M株。当人们试图查询PM株的传代历史时，可能会疑惑这株病毒是如何在WI-38细胞传代，然后在MRC-5细胞生产出HDCV或其他狂犬病毒疫苗。同样，20世纪80年代在法国，利用PM-1503株研发出纯化Vero细胞狂犬病疫苗（PVRV），2002在中国，利用PV-2061株研发出第二种PVRV[78]。

总体上说来，尽管经过一个多世纪的发展，人用狂犬病疫苗适应细胞的主要种子病毒仍是3个原始的历史分离株：PAS/PV、SAD或Flury株。目前这些历史分离株及其衍生株之间的遗传学关系很大程度上还是未知的。尽管如此，不管何株病毒，现代狂犬病疫苗应该使用能良好适应细胞培养的毒株，从而能获得高产。

传统的狂犬病毒株是根据经验在不同动物、禽类胚胎和不同的细胞系进行传代而达到减毒的目的。这种减毒方式的机制和稳定性是完全不可预测的。在反向遗传技术诞生后，发生了戏剧性的变化，能够通过清晰的遗传学方法处置狂犬病毒[79–81]。无论是在动物或是细胞培养中，每次传代后，对每个核苷酸的变化都能明确地监测。此外，对用传统方法减毒的狂犬病毒疫苗株，譬如SAD株，使用反向遗传技术可以进一步减毒。从进化的角度看，与传统的动物体内不可控传代减毒方式相比，使用反向遗传技术的减毒方式所得到的病毒是不能轻易逆转的[82]。

这些新近研发的病毒株不仅高度减毒，解决了培养和纯化过程中生物安全的顾虑，而且在细胞培养中可复制达非常高的滴度(~109 ffu/ml)，显著提高了产量。如果使用此类病毒株，人用狂犬病疫苗的常规浓缩步骤在未来的生产中可能不是必要的了。目前为止，上述任何一种病毒都还未引起人用狂犬病疫苗生产商的兴趣。如能推进相关动物模型传统的转化研究，加上在全球健康领域更为有效的沟通，可能会使这些病毒株在未来疫苗的发展中更易被人接受。在“同一个世界，同一个健康”的大环境下，最初开发的疫苗在兽用领域的推广可能预示它可能延伸应用于满足人类的免疫需求。

狂犬病疫苗只能用于预防，不能治疗。如前所述，狂犬病很独特，因为它主要采用PEP(暴露后预防)的模式。除了专门干预不可预知的人畜共患事件（譬如动物咬伤），对于这种独特性和局限性的解释有两种，都部分地基于历史的观念。第一种解释涉及到平衡风险和对病人安全的担心，因为多次注射会将大量粗制的脑组织引进发生暴露的患者体内。但仍然使用这种方法是因为疯动物引发狂犬病的威胁超过了暴露后使用NTV(脑组织疫苗)引发的副作用的威胁。第二种解释涉及到用动物脑组织生产需要多剂量使用的疫苗的可行性，由于可能会快速出现不可预知的对疫苗的需求，疫苗供应的相对短缺经常可能发生。因此，狂犬病处置主要是在事件发生后（即人已暴露于可疑动物），而不是在事件之前（典型的预防人类传染病的儿童疫苗都是提前预接种）。这种方法的相对效率在处理急性进行性传染病时不可避免地会被降低。这个事实说明，必须从疾病恶性循环的源头上来解决问题，通过对狗和其它动物进行疫苗接种来构建一个保护屏障，以防止人类患病。

从NTV到细胞培养疫苗的一个重大的转变就是减少了PEP的接种次数。随着时间的推移，由于纯度、效力和安全性的增加，成功预防所需剂量的数量和频率有所减少。例如，NTV需在超过10或14天时期内每日注射，细胞培养疫苗的接种方案已经从6剂到5剂，直到目前建议的4剂量，分别在0、3、7和14天接种。目前的一些研究表明，在未来使用皮内注射（ID）接种疫苗，接种次数可能会进一步降低。接种数量或频率的每次减少都可以减少PEP的相关费用。

目前的疫苗开发不仅取决于生产技术和病原体/免疫学知识，也取决于监管当局的管理。HDCV的开发也许是最好的例证，它开始于美国，但最终产品许可证发放落后于欧洲。在疫苗评价中，效力问题在开发的早期阶段可能会更容易解决。巴斯德完成了这一创举，通过使用神经组织的制剂来展示狂犬病是可以通过接种疫苗预防的。疫苗在随后几年进行了修改，以增加该制剂的安全性，但并没有明显提高药效，直到引进组织培养疫苗。显然，这些关注是相互关联的，安全受到效力降低的损害，例如早期的鸭胚组织疫苗。Fermi, Semple, Fuenzalida/Palacios 和许多其他人一样 (例如Hempt and H最礀攀猀)都没有对经典的毒种、基础的培养基质（动物脑），或基本的制剂作出许多改变。作为一个历史性的实体，NTV在其出现之初是新颖的，但充其量是未经雕琢的钻石，需要考虑到当前的纯度标准（特别是外来的因素，如传染性海绵状脑病）。对细胞培养疫苗中使用的稳定剂，如人血清白蛋白，仍应特别注意，稍有疏忽就可能导致疾病传播的危险。

功效、纯度、效力和安全是对任何对人用或其他动物用现代疫苗的基本要求。细胞培养技术比使用动物脑组织更具实用性和可扩展性，任何有兴趣生产狂犬病疫苗的国家都应该采用。因此，要完成从NTVs转换到细胞培养疫苗，早前的狂犬病毒毒种需要从适应脑组织到重新适应相关组织培养。已获得许可证的人用细胞培养产品，包括PHKCV，HDCV，RVA，PDECV，PCECV和PVRV，都是这样做的。此外，不同于NTV，列入世界卫生组织资格预审清单的所有现代的狂犬病生物制品都具有整体质量的可比性，涉及基本的纯度、效价和安全方面。

对廉价现代狂犬病疫苗的需要不是一个新课题，在最近几年已多次讨论。除了大的跨国制药企业，本地或区域性疫苗生产的概念也需要认真考虑，而不是只依靠进口疫苗。细胞培养，经过超过半个世纪的实践，已成为常规的疫苗生产技术。例如，与动物成为鲜明的对比，一支小的冻存管内的Vero细胞即可以无限繁殖，不断满足狂犬病疫苗生产的需要。经充分鉴定、遗传稳定的狂犬病毒能够适应这种细胞培养，确保很高产量。例如，对开发HDCV的最初设想是使用CVS、LEP和HEP作为候选，但这些病毒都未能提供足够的产量。同样，原鸭胚疫苗开始使用CVS，但随后细胞培养的适应株PM株被选定为HDCV和PDECVs的生产用毒种。此外，重新适应的CL-60、Vnukovo-32和3aG株被用来生产PHKCVs。虽然世卫组织对生产生物制剂有广泛的指导原则，但各个国家的监管机构行使产品许可的最终决定，并最终由当地临床使用和公众的接受程度来决定产品的成功。例如，在RVA获得许可证时，不适合的鸭胚组织疫苗被广泛使用，但在北美却未被批准使用。另一个例子是早期使用HEP毒株的PCECV在日本生产。但是，该产品不是后来广泛推广的PCECV，后来使用的是LEP- C25病毒株。不幸的是，疫苗分销商和监管当局的腐败现象增加了疫苗的成本，并阻碍疫苗在一些国家的推广。

在发达国家更有效的家养动物狂犬病控制措施下，与1960 －1980年代相比，对新的人用狂犬病疫苗的兴趣正在降低。此后，国际上在狂犬病疫苗商业开发中没有发生重大的更替。与此同时，在狂犬病流行的地区，在本地生产狂犬病疫苗的需求非常强烈，如中国、印度、拉丁美洲，以及整个非洲和中东。当感兴趣的部门需要传统疫苗毒种（例如，PM，PM- 1503，PM- 1503- 3M，PM-WI- 38 -1503 -3M和LEP- c25）的详细的历史记录文件，希望能加快疫苗研发的注册申请过程时，就会出现问题。正如表1中总结，这些毒种的历史充满混淆的变量，至少应当说是不清楚，不利于疫苗企业的开发。一个典型例子2002年发生在一个中国公司，它选择了所谓的PV-2061代替PM- 1503进行PVRV的生产。

纯度、效价和安全这三项标准一起决定疫苗的质量和可接受性。如同世卫组织和其他组织披露的，狂犬病毒疫苗生产的许多方面都可以重复。疫苗制造，如一般的PCECV和PVRV，如果仅仅是简单地在生产中使用了不同的毒种，应客观判断自己的优点。否则，监管部门的主观判断往往会浪费巨大的资源，而大多数狂犬病流行国家的资源本来就很紧张。当狂犬病流行国家寻找材料开始在国内进行疫苗生产时，可靠和及时的技术转移，包括合适的细胞培养基质或源自国际认可机构的毒种，可以有助于克服一些基本障碍。

近年来狂犬病毒疫苗皮内(ID)接种方案又引发新的兴趣，可作为一种替代方案，以减少PEP的成本。早在20世纪70年代末 HDCV被批准时，狂犬病疫苗ID接种方案就在人类身上测试过。自1979年以来，ID疫苗接种经常在泰国的狂犬病PEP中应用，成为泰国红十字会正式认可的一种接种方案。美国免疫接种咨询委员会（ACIP）在1982年提出ID疫苗接种方案可用于狂犬病疫苗的暴露前预防（PrEP）。1992年，WHO狂犬病咨询委员会正式提出ID疫苗接种方案可用于狂犬病疫苗的PEP。

目前预防狂犬病的主要挑战之一是当代人用的狂犬病疫苗的高成本。每年世界各地超过1000万患者需要PEP，总共需要超过5000万剂疫苗。目前，按工业规模，PVRV每批次可以生产约6000升（超过1200万剂PVRV，无需浓缩，每剂为0.5毫升）。技术不再是生产足够数量狂犬病疫苗的主要障碍。狂犬病疫苗的许多替代产品正处在实验开发的阶段，如DNA疫苗、以植物为基础的疫苗及重组病毒载体疫苗。替代开发某种完全新型的疫苗，资源有限的国家可以更现实地开始使用现有毒种，这些毒种已充分鉴定，在指定的细胞基质中能获得高产。然而，高品质的狂犬病免疫球蛋白仍然是PEP中的主要限制。病毒感染后，在疫苗诱导的中和抗体主动产生以前，狂犬病免疫球蛋白提供了一个被动免疫的重要桥梁。使用单克隆抗体可能解决这一难题。另一种可能是，高度减毒的狂犬病疫苗在其安全性获得充分的认可后，如果该疫苗能够提供迅速和适当的免疫反应，有可能避免对狂犬病免疫球蛋白的需求。

人类狂犬病可以通过避免暴露或在感染后接种疫苗来预防，但高风险地区通常是偏远和贫困地区。在这些地区，由于经济状况不同，医疗设施有限，很少或根本没有可用的狂犬病生物制剂，往往不可能及时和妥善地按推荐进行狂犬病毒暴露后处置。在疫区狂犬病疫苗的供应并不总是可得到或可负担的，这是不争的事实。即使在发达国家，狂犬病疫苗的供应量也不确定。大规模疫苗接种狗是预防狂犬病由动物传染给人类最有效的方式。然而，未来使用现代疫苗在暴露前免疫某些高风险的人群，就像应对许多其他传染病时所做的一样，是一个可行的方法，可以减少将来人类狂犬病的负担。例如，在亚马逊河流域的某些地区，原居民受夜间捕食的吸血蝙蝠的威胁，这种蝙蝠是臭名昭著的狂犬病毒宿主。同样，孩子们被动物咬伤的风险在增加，当动物缺乏或没有得到适当的控制时，应考虑改善对易感人群的医疗覆盖面。几十年的经验已经证明，当代狂犬病的疫苗的副作用是微乎其微的，最近的研究表明，这些生物制剂与全球儿童疫苗接种的抗原和时间表可以兼容，特别是在采用经济的ID接种方式的情况下。

人们在近期开发新型狂犬病疫苗的兴趣并不大，但在狂犬病流行国家，对更加现代产品的需求是强大的，例如最近在中国重新开发的PVRV，在印度重新开发的PVRV、PCECV和PDECV。从一个非常简单的角度来看，现代疫苗生产关注的是大规模生产相关生物学抗原的最佳方法，生产的关键抗原应当便于接种，并能诱导产生预期的免疫保护。对于狂犬病疫苗，选定病毒用于生产基本抗原，选择培养基质用于支持病毒的繁殖，这两者是最基本的原材料。一般来说，旧时组织来源的狂犬病疫苗，无论NTV还是简单的禽类组织疫苗，都有不可预测的抗原性，这是由于使用原始的生产方法，制剂中包含匀浆的动物脊髓、大脑或整个禽类胚胎。目前已能生产更安全、更有效的疫苗，应停止使用被历史淘汰的方法。。

应当寻找有高度细胞适应性和稳定性。在细胞培养中能达到高产的狂犬病毒减毒株。否则，如果有关方面继续把重点放在标准的方法和搜索历史株（这样的毒株可能本身并不存在，或者因长期复杂的传代史而不易得到验证），那么就可能继续忽视改进分子生物学技术以确定新的候选毒株。如果不对疫苗生产作根本改变，当前狂犬病的状况不可能发生实质性变化。有兴趣的生产商、相关科学家和疫苗监管当局应当携手合作，使本地生产的疫苗能充分供应，从而能解决在狂犬病流行地区高质量疫苗能及时、廉价分发的根本问题。