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标题: 【专题讨论】各种细胞传代培养的方法＆操作 [打印本页]

作者: hantavirus 时间: 2016-2-16 16:54
标题: 【专题讨论】各种细胞传代培养的方法＆操作
细胞培养对于病毒学实验至关重要。

传代是细胞培养中的重要内容之一，常常有人问及某某细胞传代时选择何种消化酶（及其浓度）、消化时间和具体的操作步骤，所以很有必要在这方面做些总结，以利于坛友（尤其是细胞培养新手）能够方便地查到相关资料。

现特设本专题，请高手们积极参与讨论，对于提供详细细胞特性、培养方法、操作步骤的，斑竹将给予金币或学分奖励。

要求：希望能够提供本人亲自实施过的、可行的传代方法、步骤以及培养条件（培养时有什么特殊要求也请一并指出），切忌单纯Copy甚至发布道听途说的“方法”！

作者: hantavirus 时间: 2016-2-16 16:56
本帖最后由 hantavirus 于 2016-2-16 16:58 编辑

抛砖引玉：养BHK-21细胞的经验：（转自wwwkkk83）

BHK-21细胞特性：

是幼年叙利亚地鼠肾细胞（Baby Hamster Syrian Kidney ）。1961 年3 月，I.A. Macpherson 和 M.G.P. Stoker 从一日龄叙利亚地鼠肾分离建株，经过84 天连续培养，获得单细胞克隆细胞，即clone 13 或C13。BHK21 细胞广泛用于增殖各种病毒，已成为制备口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想细胞培养系，应用于口蹄疫疫苗生产，之外还可用于生产狂犬疫苗等其它兽用疫苗。BHK21 细胞染色体分布频率是n＝44，为异双倍体细胞系，4 倍体发生率为4％，大多数细胞核型分析为44，XY，-6，-15，6q+，15q+。原始的BHK21 细胞株为成纤维细胞，属于贴壁依赖性细胞，后经无数次传代后细胞可悬浮生长。

传代方法：
除去旧的培养液后(吸得越干净越好)---用PBS缓冲液(或hanks)冲洗一遍----用1毫升0.22%的胰酶(0.02的EDTA)消化；（37度液消化约1-2分钟左右可以看到细胞像沙子一样脱落）——赶紧倒掉胰酶加入5ml左右含10%的牛血清培养液终止消化，轻轻吹打下，细胞就全部脱落分散。

如果细胞长得太老，可以先加入1ml胰酶在细胞表面浸润一下就吸出来，然后再加入1ml胰酶消化。
胰酶在使用前预热到37度。
消化时间的选择要根据实际情况决定，BHK-21还是比较好消化的，消化时间太长对细胞不利。可以在显微镜下观察消化情况，必要时可以拍打培养瓶帮助细胞分散。

在90％单层细胞时，1：4传代2天后可长满。

可参考ATCC：http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CCL-10&Template=cellBiology

美国ATCC保存BHK21细胞株，编号为 CCL-10，为C13 克隆株。对于BHK21细胞， ATCC 推荐使用的培养方式为：使用含10％胎牛血清的MEM 培养基进行细胞培养，细胞培养温度为37.0°C，细胞培养后使用0.25％胰酶和0.03 ％EDTA消化细胞，细胞分种比例为1：2－1：10，每周1－2 次细胞传代。

作者: missann111 时间: 2016-2-18 15:59
我养的hep-2细胞，操作流程如下：
1 取出T25细胞,已长满瓶子。
2 弃生长液。
3 用5ml PBS洗涤两遍。
4 加入0.25胰酶+0.02EDTA 1ml，使之铺满整个细胞。
5 37℃消化1-2min，至细胞圆缩，间隙变大，为单个分开，弃胰酶。
6 加入培养基5ml，吹洗掉全部细胞。
8 按照传代比例1:3加入生长液（10% FCS 1640），37℃培养

C6/36细胞，操作流程如下：
1 取出T25细胞,已长满瓶子。
2 弃生长液,尽量倒干净。
3 直接加入5ml生长培养基吹打，轻轻吹，不能拍打瓶子，贴壁较牢的不能吹下，不能加胰酶。
8 将吹下的按照传代比例1:2加入生长液（40%1640+60%DMEM+10%FBS），28℃培养

RD细胞，操作流程如下：
1 取出T25细胞,已长满瓶子。
2 弃生长液。
3 用5ml PBS洗涤两遍。
4 加入0.25胰酶+0.02EDTA 1ml，使之铺满整个细胞。
5 37℃消化1min，至细胞圆缩，间隙变大，为单个分开，弃胰酶，不能拍瓶子。
6 加入培养基5ml，吹洗掉全部细胞。
8 按照传代比例1:3加入生长液（10% FBS MEM），37℃培养

作者: yafei 时间: 2016-2-18 16:05
我们养的是MRC-5细胞，细胞刚开始复苏的时候状态还可以，细胞密度也是够的，但是细胞生长的特别缓慢，需要十几天才能长成单层，而且溶液里有一些圆缩的细胞，还有一些黑色的小颗粒，细胞形态变得比较乱，不是典型的成纤维细胞的样子了，然后消化之后再传代，细胞仍然长的很慢，形态变得更加不好，最后很难传下去了。我们用的是MEM+10%小牛血清，消化用的是胰酶-EDTA消化的。麻烦给点意见

作者: cao1976 时间: 2016-2-19 16:38

yafei 发表于 2016-2-18 16:05
我们养的是MRC-5细胞，细胞刚开始复苏的时候状态还可以，细胞密度也是够的，但是细胞生长的特别缓慢，需要 ...

照你的描述分析，估计是冻存环节出了问题，复苏10几天长满那是肯定不对的  你用的生长液消化液是常规的东西应该没问题。
不是怀疑你的技术仅仅分析原因别见怪：
二倍体细胞  相对于其他细胞系属于很脆弱的。
复苏的速溶是否妥当，速溶环节很容易造成细胞死亡。
复苏后换液是否及时，残留的DMSO对细胞生长是有毒的，虽然他能用来冻存。
细胞的代次，这细胞分散到各实验室后其生长状态也有很大的差异，有的可以传代到60 有的70  有的却只有50 ，所以要看你拿到的细胞本身怎么样，疫苗生产要求的是寿命2/3代次使用，一方面是保证安全性，同时也是有其生长状态的原因的。一般在40代以内应用，其活力水平会比较高。

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