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标题: 慢病毒骨架质粒的扩增 [打印本页]

作者: niuhuanhuan55 时间: 2016-7-15 11:57
标题: 慢病毒骨架质粒的扩增
最近重新转化提取了慢病毒骨架质粒，相同的一个质粒，大提和小提分别提取的质粒，跑琼脂电泳，条带很不一样，不知道哪次的质粒提的好可以用？是同一个质粒，请问哪个是好的？
注：1,2，是用碧云天大提质粒盒提取的；3,4,5使用Invitrogen小提质粒盒提取的。
1, 是用购买质粒的母液转化后直接大提的
2，是用1保存的甘油菌种扩增后大提的
3,4,5，是质粒母液转化后小提的

酶切过夜后跑胶（2个酶切位点，PstI 9622 PstI 9719）

上面的胶跑了30分钟，再跑15分钟，跑的更开一点，见下图：

作者: ipsvirus 时间: 2016-7-15 15:21
质粒抽提后直接跑胶，情况很复杂。多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性 DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌(Escherichia coli)基因组DNA的片断。非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。
所以看酶切图谱更准确。

你使用的酶虽然有两个酶切位点，但是酶切后一个片段太大，另一个又太小了，不好观察，建议使用其他酶，或者双酶切等。所以从你目前酶切结果来看，好像只有大提2是正确的。

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