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标题: 慢病毒滴度检测 [打印本页]

作者: niuhuanhuan55    时间: 2016-7-15 12:04
标题: 慢病毒滴度检测
本帖最后由 niuhuanhuan55 于 2016-7-15 12:06 编辑



Protocol:
1)   转导前一天(第 1 天),胰酶消化细胞并计数细胞密度,按照合适的细胞密度接种到 6 孔板中,能使转染当天的融合度达到 30%-50%。 放置 37℃、 5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养。例如:如果用HT1080细胞测定滴度,通常一个六孔版的孔接种 2×105  个细胞; 我用的细胞是HT29。
2)   转导当天(第 2 天),融解病毒,准备 10 倍稀释系列样品,稀释倍数从 10-2到10-6。对于每一个稀释样品,用完全培养液稀释病毒至总体积 1mL。避免漩涡震荡;  
3)   去除细胞中的培养液,加入已含有不同病毒量的完全培养液。另外,保留一孔不添加病毒的细胞,作为空白对照组。注:每孔加入的培养液的体积应为 1mL;
4)  (可选)在含有病毒的培养液中加入聚凝胺,促进病毒感染细胞。轻轻地摇晃培养板以混匀聚凝胺。放置 37℃、5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养;  
注:一般 polybrene 的储液浓度是 6mg/ml(用超纯水配制,-20 度储存,注意分装,反复冻融三次以上将大大降低效果)。工作浓度是 6ug/ml。
5)   转染后一天(第 3 天),去除含有病毒的培养液,加入 2mL 新鲜的完全培养液。放置 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱过夜培养;
6)   转染后两天(第 4 天),去除培养液,加入含有适当浓度的嘌呤霉素的完全培养液以筛选稳定转导的细胞;  
7)   每 3 天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液;
8)   筛选数天后,可以看到对照组没有活细胞,而添加过病毒的 1 个或者更多个的孔会出现药物抗性的克隆。去除培养液,用 PBS 洗涤细胞 2 次。注:筛选所需天数应以对照组的所有细胞死亡为准;
9)   加入龙胆紫染色液(6 孔板每孔 1mL)并放置室温孵育10 分钟;
10)   去除染色液,用 PBS 洗涤细胞 2 次;
11)   计数被染成蓝色的克隆数目,并计算病毒滴度。

我的6孔板(除了空白对照上什么都没有),都是蓝色的针尖大小的小点无法计数,只有在显微镜下可以看到被染成蓝色的贴壁细胞,和一些细胞碎片及染料沉淀。没法计算滴度,不知道各位有什么好办法? [/td][/tr]
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作者: ipsvirus    时间: 2016-7-15 15:53
a.我都会在plybrene后会将板子1200g,离心30min,可以增加感染效率。
b.你的puromycin使用浓度在实验之前有确定对HT29的最低杀死浓度吗?对病毒感染后就用这个浓度去筛。有可能你用的浓度太高,所以细胞都死了,染出来的都是死细胞,即使成功感染的也不能生长。
c.直接数个数当成滴度不准。

作者: niuhuanhuan55    时间: 2016-7-15 16:47
多谢管理员的指导,




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