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标题: 包涵体表达小技巧之一：快速增值和收获包涵体 [打印本页]

作者: atfsu15 时间: 2016-8-21 15:43
标题: 包涵体表达小技巧之一：快速增值和收获包涵体
看到这么多厉害的技术，只能感慨自己落后了，写点常规基本技术充充门面吧。
关于包涵体蛋白表达，菌种BL21（DE3），质粒PET41，双抗，内藏目标蛋白X。

牛牛菌种的获取：100ml LB液体培养基，加入2-5倍于常规的抗生素量，再1：50加入已经转入质粒的菌种，220 rpm 37度，转啊转，转法是，选择底部有凹凸的瓶子，或者把你的瓶子倾斜（水平夹角约70度），目的是保证转的过程中培养基溶解大量空气进去（有泡沫为证），我发誓，它们喜欢这个。当培养基的OD600达到0.5或略低于0.5（摇之前做好对照啊），收菌，做成含30%-50%甘油的储备菌，-80保存。这种菌，由于培养基抗生素含量高，所以都是“摔打”出来的，而且还处在对数期，为年轻一代，故称牛牛菌种。选一个无聊的上午接菌，晚饭前就有甘油菌了。

表达开始在一个慵懒的上午，早上8、9点，手持你的甘油菌快速解冻，1：100加到100ml 含有正常量抗生素的LB液体培养基中（不用超标加抗生素了），220 rpm 37度，注意还是要溶解很多空气进去，保证它们喜欢。

2个到2个半小时后，也就是11点左右，把你唤醒的菌种1：100接到你的大瓶培养基中（常规抗生素含量），此时你的牛牛菌依旧年轻奔放而活力四射，依旧220 rpm 37度，保证要有大量泡沫，然后你可以去吃饭和睡午觉了，当然，别忘了把诱导剂拿出来放在4度化冻。

2小时或2个半小时后，也就是1点到2点之间，你的菌液OD600已经可以达到了0.5-0.6了，此时加入诱导剂，比如IPTG，诱导3小时，依旧是快摇，保证有大量泡沫，哦，诱导时盖子要有缝隙，保证外界空气能进去。放心，有抗生素和优势菌在，外面的菌进去活不长。

5点到5点半，收菌，4度10000 G 离心10 min，弃上清得到沉淀。

此时你有几种选择，第一，把菌冻起来回家吃晚饭，一切明天再说；第二，吃完晚饭过来，不嫌麻烦的话用预冷的PBS重悬菌，再离心以去除某些杂质（反正我是不做这一步的）；第三，把装菌的离心管扔到液氮里，再拿出来室温化冻，加入你用的裂解液（根据Novagen的建议），然后放到摇床上200 rpm 摇10 min，裂解液就可以把菌块全化了。

如果你迫不得已或者打算餐后做消食运动，可以进行菌液的裂解。要不然就留给明天吧。

在这里强烈推荐Novagen的BugBuster Mix，很好用，参照它的说明就可完成裂解。不足之处是贵了点。

Lysis A 裂解液配方：50 mM Tris.Cl，5 mM EDTA，150 mM NaCl，0.5% TritonX100，0.5%去氧胆酸钠，pH 8.0 （这个配方也许源于分子克隆，但是自己想当然配的，没看分子克隆）。
Lysis B 裂解液配方：50 mM Tris.Cl，150 mM NaCl，0.5% TritonX100，pH 8.0。

Lysis A 一般是1g湿菌加入10-20ml 裂解。

此时你有两个选择，第一，超声波破碎菌体（我从不玩机械破碎）；第二，加入终浓度25-30 U/ml 的Benzonase和终浓度为1KU/ml 的rLysozyme，37度摇床30min。实际上，我经常画蛇添足地先超声再加酶摇。

4度16000 G 15 min，得到沉淀。

重悬沉淀用Lysis B，无论你想用涡旋还是吸管吹，都没问题，加多少LysisB 也没影响，只要能悬散就行，如果不放心，还可以加入rLysozyme或者Benzonase，浓度同上，室温或37度晃荡10min。

为何用Lysis B？嗯，如果你的下游实验是IMAC，大概不希望EDTA螯合你的柱子上的金属离子，而且，剔除作为阳离子去污剂的去氧胆酸钠也没什么坏处。当然，可以用无EDTA的蛋白酶抑制剂替代EDTA，然后不加去氧胆酸钠，那么你就只需要一种类似于BugBuster的裂解液了。当然，我不知道BugBuster的配方，也不想另加蛋白酶抑制剂。

用重悬后的沉淀可以10000 G离心10min后再用LysisB重悬，这个步骤可以做3次，然后用PBS重悬一次（PBS量可以大一点，以充分稀释TritonX100），16000 G 15 min，得到的就是包涵体了。

到这里可以冻上，也可以加进变性液变性，无论6M盐酸胍或8M尿素，带上0.2M磷酸盐或者参照分子克隆配方，但保证pH8.0为宜。感觉变性液吹不散包涵体的话，可以超声（大功率、间歇）打散包涵体，放心，三四百瓦特的功率打不碎蛋白，只会打烂核酸。你可以让它37度摇1小时到3小时，或者室温、4度之类过夜，有变性剂在，你的蛋白很安全。

轻点拍砖

作者: 序道 时间: 2016-8-23 11:10
不错，很不错

作者: hantavirus 时间: 2016-8-23 11:29
的确不错

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