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标题: 包涵体表达小技巧之二：机器玩重折叠 [打印本页]

作者: atfsu15 时间: 2016-8-21 16:46
标题: 包涵体表达小技巧之二：机器玩重折叠
以Ni柱结合His为例，市售Sepharose柱子或者NTA都行，差别是，NTA有更多的金属离子结合位点，理论上说能结合更多蛋白，而且NTA能承受的压力上限要高一些。这里的重折叠过程不太适合超滤的步骤，仅针对IMAC。

柱子结合Ni可参照说明书，结合后，建议将水洗过程换成复性液洗涤，复性液配方为：8M尿素或者6M盐酸胍，0.2M醋酸，pH4.0。酸性条件不利于蛋白上柱，所以洗一次就行，剔除结合未稳的Ni和柱子表面可能有的杂质，然后加入你用的变性液洗涤平衡柱子，使柱子适应pH8.0的环境。不过千万别总把柱子泡在变性液里。

加入变性好的蛋白溶液，室温1小时振荡结合即可，不要太剧烈，保证柱子不沉下去就行。

我们在使用超滤时，往往无法避免蛋白在重折叠过程中发生聚集的情况，所以加入DTT以防止S-S的形成。而对于上柱的蛋白，优势在于，可以直接在柱子上重折叠，而不必担心蛋白间形成聚集沉淀，缺点就是不能大量生产。

以机器纯化为例，使用FPLC或者AKTA。

变性液（A），重折叠液（B），重折叠液即为剔除了变性剂的A。

N种方案，捡几种来说。

A液为起始100%，B液为终末100%，逐渐用B液完全替代A液，对20ml 以内Ni柱，设总体积300毫升洗涤，流量为0.8ml/min，压力上限对NTA为0.5，对Sepharose为0.3，其实实际运行中很少超过0.1。

在开始你会看到屏幕上UV值暴涨，那是因为很多未结合和结合不稳的蛋白被洗脱，里面有目标蛋白也有杂蛋白，不用管，1小时后UV值就会下降到一个恒定值。这个过程会持续约6小时，随后可以看到B液浓度开始走水平，表明过柱的已经是100%的B液了。不要急着收，让其再运行30min。这时目标蛋白就完成了重折叠。可以参考常规洗脱办法了。

注意在这个方法中，不含有任何还原剂，如DTT或2巯基乙醇或者还原型谷胱甘肽，仅有变性液含有变性剂，仅有洗脱液含有咪唑（500mM），全部剔除甘油。所需液体仅三种：变性液、重折叠液、洗脱液。如果觉得配置6M盐酸胍或8M尿素是一种痛苦，以上步骤不失是一种简单实用的技术。当然，整个过程最好在4度，最起码也得用冰水不间断流过柱子外围，保证纯化的蛋白具有活性。一般认为，8M尿素在4度会析出结晶，所以推荐6M盐酸胍，实际上，由于整个过程液体都在流动，8M尿素不会析出，它仅仅比盐酸胍在静止状态下容易析出，两者析出特点的区别仅仅在于尿素在4度会更短时间就析出，而盐酸胍花的时间更长。

两个建议：
一、重折叠液可以是pH8.0，也可以是pH6.0这样的酸性，根据你的蛋白最后要的工作条件。如果你的蛋白需要在弱酸性条件或中性条件下工作，建议将重折叠液调为pH6.0，然后洗脱液和透析液也是pH6.0。如果重折叠液是pH8.0，洗脱液是pH6.0，一些天生具有聚集特性的蛋白可能在透析时发生小范围聚集，但会让人很不爽。pH6.0的重折叠液也有缺点，就是蛋白容易在重折叠过程中损失一些，因为弱酸性条件并不利于His挂Ni柱，但这个损失很少，相反可以洗掉很多非特异蛋白。有一些老式步骤中使用低浓度咪唑（比如10 mM）来剔除非特异结合，结果是一样的。

二、这个重折叠可以设定为总量400ml，流速0.5ml/min，那么晚饭后做上就可以回家睡大觉了，第二天早上再来洗脱，不过确保过夜的液体得够啊。

作者: 序道 时间: 2016-8-23 12:39
除了Ni柱纯化，还有更好的纯化方法吗

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