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标题: 包涵体表达小技巧之三：手工玩重折叠 [打印本页]

作者: atfsu15 时间: 2016-8-21 16:47
标题: 包涵体表达小技巧之三：手工玩重折叠
先声明，关于这些技术，我数年来参考了很多方案，后来自己摸出了此步骤，如果有类似的方法已经见诸文献，纯属巧合，呵呵。

手动步骤是无法使用机器的下策。

所有液体配方同机器纯化方案，但重折叠过程略作修改。

A液洗涤数次，直到你感觉行了，一般是3-5次，每次5倍柱体积，洗涤过程最好是4度摇床缓慢振荡，以不使柱子沉淀的强度为宜，每次2min足矣。每次洗了都要低速离心（1000 G 5min），弃上清。

设N个梯度，每个5倍柱体积，A:B体积比分别为：10/0，9/1，8/2......1/9，0/10。依次洗下来以使B液缓慢替代A液。每次洗同样是4度轻振荡2min，5倍柱体积，然后低速离心弃上清。最后还要用100%的B液洗两次，保证干净

关于pH值，与机器洗涤方法同样。

一些额外的建议：
一、以His标签为例，如果你感觉6x His标签会影响下游试验，那么分析你的蛋白序列，如果自带10个以上His，不妨在构建质粒时选没有标签的载体，一样可以很好结合，只是要保证手动洗涤时不会剧烈振荡。如果你担心蛋白自身的His结合柱子之后会影响重折叠，实际上要是带了His标签的蛋白也是无法保证结合柱子的都是标签的蛋白，而且根据我手上的FTIR结果，利用蛋白自身的His结合后得到的重折叠蛋白依旧是类似天然构象。

二、如果无法保证在4度完成重折叠和洗脱过程，那么就按原始方案保留A、B液和洗脱液中的甘油。不过透析液中最好不要有甘油。

三、透析之前，务必清楚自己的透析袋的MWCO值，别把目标蛋白透出去了。以上步骤得到的蛋白透析过程相对简单，加进100倍蛋白体积的透析液，4度透析1-3小时，再换100倍体积新透析液透析4小时或者过夜就行了。如果不放心里面的咪唑，还可以多透一两次。

强调：透析液最好不要是dd水，而是缓冲液。可以根据自己的下游实验自行设计透析液。但是最好不要带有下游实验反应缓冲液中不存在的成分。比如，你的下游试验如果是蛋白相互作用，而缓冲液不含钾离子，那么透析液也就不要含钾离子。

该方法同样适用于GST之类标签的需要重折叠的蛋白。透析后的蛋白若感觉浓度不够可以用超滤管浓缩，同样务必注意超滤管的MWCO......

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