20 世纪末,Vogelstein 等提出数字PCR( digitalPCR,dPCR) 的概念,通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元,每个单元至多包含一个拷贝的目标分子( DNA 模板) ,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。
数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法,光度法基于核酸分子的吸光度来定量;实时荧光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值,Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数;数字PCR是最新的定量技术,基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量,是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法,将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中,每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后,有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号,没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积,就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
利用与核苷酸加入相关的pH变化对核酸扩增反应进行电学检测能够使得测试装置小型化和具有更大的可移植性,并且降低成本。然而,当前的检测核酸扩增反应的离子敏感场效应晶体管(ion-sensitive field effect transistor, ISFET)方法依赖于在一种体积庞大的难以精密加工的参考电极上建立流体门控电势,然而因其难以精密加工也就限制了进行大规模平行反应检测的潜力。
在一项新的研究中,来自美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的研究人员展示了利用一种将pH不敏感性参考场效应晶体管(reference field effect transistor, REFET)与微加工固态准参考电极(quasi-reference electrode, QRE)相配套使用的方法能够检测实时的pH变化。最终的结果是研究人员开发出一种0.18μm的绝缘体硅片铸造的传感器,这种传感器利用铂QRE建立一种pH敏感的流体门控电势,并且利用一种聚氯乙烯(PVC)膜REFET能够基于pH变化对环介导等温扩增(LAMP)进行检测。这种技术非常适合进行商业化扩大生产,降低对ISFET pH检测的包装和制造需求,而且能够大规模地进行平行液滴测量,如监测数字PCR中的反应进程。