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标题: Co-IP 免疫共沉淀实验对照设置和 trouble shooting [打印本页]
作者: wwwkkk83 时间: 2017-1-17 11:07
标题: Co-IP 免疫共沉淀实验对照设置和 trouble shooting
以下转自网络：
最近在不同技术论坛上溜达加上客户的来电咨询，发现 Co-IP 免疫共沉淀的实验小伙伴做得并不是很顺利，遇到的问题也是千奇百怪，有什么条带也没有检测到的，有泳道一片漆黑的，有出了条带但位置大小还不对，真是让小伙伴们伤透了脑筋，万变不离其踪，做实验之前我们先系统地的了解一下实验各个环节的一些基本概念和注意事项，以及如何设置完整的对照以便出问题时快速分析原因。
免疫共沉淀实验原理介绍：
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation），简称 Co-IP，其原理是当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来, 如果用蛋白质 X 的抗体 anti-X（通常称为 IP 抗体）将 X 特异地抓住并沉淀下来，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y 或者 Z 等也能共同被沉淀下来。目前多用 protein A 或 G 预先固化在琼脂糖或者磁珠 beads 上，protein A 或 G 可以结合各种抗体，具有通用性，当然它们结合不同种属来源的抗体的亲和力有差异,比如 Protein A 结合兔抗的结合力比 G 稍强, 具体需参考产品的说明书。
因此利用 Co-IP 实验有以下作用：
（1）测定两种甚至更多种蛋白质是否在体内结合；
（2）鉴定一种特定蛋白质的作用搭档；
（3）分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
不同材质的 Beads：
早期的产品 beads 是采用琼脂糖做成的微球，通过离心沉淀到管底，因颗粒小容易被搅动起来，因此在 wash 的步骤移液动作要非常小心，不能吸走了 beads 也不能残留太多的液体，否则靶蛋白有损失或者残留液体可能导致假阳性信号，而且琼脂糖的beads 为多孔结构在长时间的孵育过程中也会有各种蛋白质进入到孔隙中在最后洗脱时都被煮出来了而导致背景不干净，逐渐新的材质磁性 beads 就诞生了，磁珠采用磁力架沉淀，沉淀清洗方便又快速，所以越来越多的实验室采用 Co-IP 磁珠, 如 Bio-Rad SurebeadsTM。详见 SureBeads 磁珠简单快速的操作方式。
实验对照的设置：
一个成功的 Co-IP 实验，首先得证明靶蛋白 X 和预测的相互作用的蛋白 Y 存在于蛋白质样品中，所以抽出来的蛋白样品要直接检测一下 X 和 Y 的存在，这个一般称为 Input。
然后要证明 IP 抗体是不是能拉下来靶蛋白，做完IP后要检测一下靶蛋白，这里要特别注意了，很多实验室用western的一抗作为 IP 抗体，觉得 WB 能行IP也一定能抓住靶蛋白，这可是不一定的，因为 western 检测时靶蛋白是变性的状态，空间结构都打开了，很多抗体在制备时使用的是合成的肽段作为抗原，这样的抗体不一定能识别非变性状态下折叠起来的靶蛋白，只有实验验证后才知道是否能用于 IP 实验，所以选 IP 抗体时一定要注意抗体的介绍上提到的 application，可能会有 ChIP, Flow Cyt, ICC/IF, IHC-P, IP, WB 等，而且即使购买的抗体说是可以用于 IP 的，其在不同样品中的效果还是自己检测了才知道， 如果靶蛋白没有出现，就不必急着检测 Y 了，先分析原因，要么 IP 抗体有问题，这个就要换不同的抗体试了，要么 beads 没有结合上 IP 抗体，这个倒是可以通过 WB 来检测是否包被好。
当然如果直接做内源性 Co-IP，就怕 Input 也没有出来，这样就搞不清楚是不是样品本身靶蛋白含量太低或者蛋白抽提没有做好的原因， 遇到这种情况，我只能建议步子小一点，先做过表达的 Co-IP 吧。
IP 后 X，Y 蛋白都能检测到，固然是值得高兴的，但是这结果是不是假阳性呢？还得做个阴性对照，目前看到文献中提到有四种方法：
（1）只加入 beads 不加入 IP 抗体
（2）加入一种不相干的蛋白的抗体作为 IP 抗体
（3）加入正常 IgG 作为 IP 抗体
（4）使用不表达靶蛋白 X 但表达 Y 的蛋白样品做对照。
只有以上对照都放了，出来的结果才是可以去解释的。美美的图片是像这样的：
IP 指的是使用这个蛋白的抗体来包被 beads，IB 指使用某抗体去检测沉淀下来的蛋白
这里的 IgG 就是做阴性对照用
影响 Co-IP 结果成败的其它因素：
除了以上这些在实验设计时需要注意的，蛋白样品的表达，抽提，Co-IP 的 wash 和洗脱步骤也是相当重要的，敬请期待后续报道。
作者: wwwkkk83 时间: 2017-1-17 11:08
作者：jacqueslm2001
一.样品的制备。
如《WB指南》，在这里我最强调从制备样品开始的一致性。如果不触及细胞的凋亡或死亡，那么任何处理组样品和ctrl最后的终体积应该保持一致；如果细胞有大量凋亡或死亡，可以通过比对标准体积对样品的体积粗略定量后再加裂解液，一般可以把误差控制在WB的检出范围以下，基本保持样品的均一；组织样品可以通过称重添加相应体积比的裂解液。
裂解液的配方可以采用《WB指南》里给出的，原配方如下：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors（0.5M PMSF)
此裂解缓冲液裂解条件相对温和，适合后续的coIP分析。
“不过”用它做coIP有明显的缺陷；
要理解此配方的缺陷，我们先聊聊如何在coIP实验中“作伪”。
伪造结果，也分为单纯性造假和技术型伪造。撇去前者，从技巧上来讲，如果要想获得设定、预想的相互作用结果，可以从几个角度着手——此类结果可重复。
a.在低盐离子裂解液中进行IP。
很多蛋白复合体对盐浓度敏感，但敏感性有强弱之别。通常来说，真实存在着的蛋白复合体能耐受生理盐（0.15M）或更高浓度，即在生理盐浓度下不会解体。具体如，某种CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M以上的高盐而不解体，即使其抑制蛋白CKI能耐受0.6M以上高盐。因此，了解一个蛋白复合体对盐浓度的耐受，既是一个帮助判断蛋白复合体是否真实存在的一个重要依据，更是一个非常重要的生化数据；对某些体外生化反应的蛋白原料的纯化制备也是很重要的辅助依据。例如，纯化有生物活性的CDK和Cyclin，如果采用盐浓度漂洗，则最低需0.6M以上以解离CKI。所以，在生化领域的coIP分析中，很多实验体系的盐浓度是比生理盐浓度更高的。当然，不排除某些弱相互作用需要生理盐浓度，但这种情况不多见；也容易跟瞬时的相互作用混淆，某些实验中的弱相互作用实际是由于生化反应的瞬时性，且缺乏有效的截留、富集手段，诸如酶和底物。
很多非生化领域的，喜欢在生理盐或更低盐浓度下进行coIP，这大大增加了假阳性的几率——很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来。这也成为了获得“设定的”相互作用的有效手段。
b.过表达。
现在已经存世的相当多的实验论文和数据，其蛋白复合体相互作用的数据是通过过表达，甚至原核GST pulldown获得的；笔者认为，在阅读这类文献时，大家要特别小心，多长一个心眼——即始终抱怀疑的态度。并非说一定不可取，但是有一点很明确，这样的数据送到我们手里，首先我们会要求对方补充内源性蛋白相互作用的证据，否则该结果一律不采信。
在《WB指南》里面我提过，血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别（其实也是一种相互作用），那么同理高丰度的两种或多种蛋白人为拼凑到一起，为什么不可以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用呢？
因此，如果想要“特定”的相互作用，可以考虑过表达所有的蛋白，就是核蛋白结合胞浆蛋白甚至膜表面受体也不稀奇。
c.不添加NP40一类表面活性剂，削弱对非特异性结合的拮抗。
NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效的拮抗非特异性的蛋白相互作用，提高coIP的特异性。因此，减少或不添加NP40也可以辅助“预期”目的。
实际上，掌握a、b两点技巧，基本上可以“无往而不胜”——彻底搞定一切“想要的”相互作用。
基于以上的原因，如果想获得切实可靠的相互作用数据，那么裂解液的选取相当讲究。
1.首先盐浓度至少0.15M或以上。
盐浓度主要指Na盐浓度。有人会问为什么不是钾盐？因为钾盐会更容易跟某些试剂（或离子）形成沉淀，诸如SDS，因此在某些情况下，钾盐会对后续的某些实验带来未知的麻烦，所以一般盐浓度指Na盐。盐浓度过低对某些与染色体结合较牢的蛋白的抽提（非破膜的温和裂解）效率也较差，可能会丢失部分信息；而盐浓度过高又会造成某些相互作用较弱的复合体解体，因此，通常选择0.15——0.3M做细胞裂解。纯化蛋白通常选取0.6M以上进行IP。
小技巧：最初几遍的漂洗buff要和IP时的盐浓度相同。经验上，纯化蛋白时，若用低盐裂解细胞、高盐漂洗去杂质，蛋白丢失较多；所以，一般如前所述。当然，也可以高盐裂解低盐漂洗，但是对除杂质不利。
2.通常IP体系中NP40含量0.2——0.5%。NP40在0.5——1.0%时，染色体很容易析出（很黏，成胶状会裹住beads，同时粘下很多蛋白），用这样的裂解液破碎细胞则可能需要超声。通常由于习惯上避免增加不必要的操作，所以在非必要的情况下，选择前述的浓度区间。
3.可适当添加EDTA，螯合金属离子保护DNA和蛋白。特殊情况下还可选择添加EGTA，螯合Ca2+研究钙相关蛋白。此外，裂解液中甘油浓度一般介于15%-20%之间。
4.很多市售或自制的裂解液过于温和，需要考虑采用机械或者超声等手段提高裂解效率（超声要慎用，可能破坏弱的相互作用）。但是，有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱的相互作用，所以不太建议冻融裂解液——即最好裂解液制备好后立即进行coIP。当然，如果证实冻融无影响可考虑将蛋白样品保存-80度待用，这对实验日程的安排会更平易。
5.裂解产物的蛋白浓度越高越好。前几日回复一贴子，不知道出于什么动因该LZ主动稀释裂解样品的蛋白浓度再IP，所幸不是做coIP。上面提到过表达会制造相互作用的假象，反过来说蛋白浓度过稀，某些相互作用就测不到（不一定是弱的相互作用）。因此，细胞的裂解效率会直接影响实验的结果。通常细胞裂解产物的蛋白浓度可达7-8mg/ml左右，但是更常规的现象是达不到这种浓度；当然不是说低于7-8mg/ml就不能进行coIP，只是需要考虑这一因素。因此，在多数情况下要尽可能避免稀释你的细胞裂解液。
【补充1】：
切记！实验要先有结果再来挑战极限！
在不少人的提问给出的流程中，其开始的样品量往往是以6 well或者60mm dish为单位的；不否认某些蛋白或复合体确实可以在如此苛刻的条件下完成coIP。但是，更多的时候不是这样子的。以我自己研究的复合体为例，其内源性IP最低起始细胞数是40-50% confluence的145mm dish；比这个数目更低，实验结果就很不稳定甚至无信号。当某些药品、试剂非常昂贵时，鄙人才会勉为其难。否则，一律2 dishes 100% confluence，可以elute成30ul跑两次；相互作用微弱时，15ul仅跑一次；再弱，多养几块板（CE增加抗体和beads仍可保持不变，因此只浪费培养基总比浪费一个冗长的时间走麦城要好）。后续若为质谱分析，需考虑小规模量产。
二、IP前的准备工作：
coIP:分为内源性蛋白的相互作用和非内源性蛋白相互作用（后者包括外源蛋白之间以及外源拖内源蛋白）。
非内源性蛋白的相互作用，主要是通过过表达来实现，通常为简化实验、提高IP效率会让外源蛋白带上标签（tagged；这也是没有相应的可用于IP的内源蛋白抗体之前唯一可行的方案），因此就tag的使用而言存在很多小技巧。
a.His-tagged主要用于纯化蛋白。有些人喜欢用His-tagged蛋白然后进行coIP，实际上它存在潜在的隐患。当初鄙人用Sigma a-His（鼠单抗；免费广告）WB外源蛋白发现CE里面一塌糊涂（带型漂亮就是非常多的带），那时候还抱怨这个抗体特异性不好。后来，当了解到很多蛋白会有富含histidine的domain以后，恍然大悟，恰恰是因为效价非常好，所以很多内源性的蛋白都被该抗体识别。同理，如果用Ni-NTA beads去PD His-tagged的蛋白，完全有可能PD那些内源性的富含histidine domain的蛋白，造成coIP的假象，而这样的蛋白还非常多。
那么，当初开发His tag的主要目的，个人认为主要是可以用廉价的化学试剂洗脱，且Ni-NTA beads这类非抗体类的beads成本低廉，可大量工业生产。因此，用这个tag去生产有活性的蛋白是首选。
b.tandem-tagged不能用于分析钙调信号通路。tandem tag实际上从成本角度和His tag差不多，洗脱试剂价格低廉，因此可用于大规模PD之后的质谱分析，能获取最全面的相互作用的信息。然后由于其中包含钙调蛋白相互作用domain，天然会结合钙信号相关蛋白，从而干扰或掩盖靶蛋白与钙信号蛋白之间的相互作用，有一定的应用局限。当然，笔者不太清楚近年来该方法有无改进，但正是由于引入钙调domain才实现了降低成本的目的，因此猜测可能性不大。
c.Myc、HA、Flag-tagged：
Myc仍然会有天然的干扰，应用略有局限；相较后两者是人工合成专门用于tagged蛋白（有相应的专利，因此目前无论抗体或交联好的beads价格都非常昂贵），因此干扰最小、最常用。如需进一步细致区分，a-Flag效价比a-HA略高，因此更适合IP。当然，公司仍在努力寻找效价更好的a-HA以及IP HA的抗体（Flag系Sigma专利，因此目前只能忍受其过高的定价）。那么，之前颇流行的a-HA鼠源单抗（其clone名称为12CA5）为何被潜在地摒弃了？
原因大概是：该克隆株可以轻易获取，流传甚广，因此可以取腹水自制；效价不高，特异性很差。尤其是特异性的问题，用该抗体去交联的beads做coIP，隐患很大（可以轻易PD非常浓的非特异性蛋白）——因此，购买商品化a-HA beads时，请仔细阅读产品说明（避开12CA5系列）。
还有GST等等，不一一列举了。
d.tag的位置。将tag构建到蛋白的N端还是C端，也是一个潜在的能够影响coIP结果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信号肽，如果将tag构建到N端，则外泌时会被信号肽酶连同信号肽一起切除；所以这时必须构建在C端。再如，多数蛋白的C端是疏水区，有的时候将tag构建在C端会影响蛋白原来的空间结构，如恰好C端同时是相互作用的结构域，某些时候还可能被遮蔽，从而干扰相互作用。因此，通常构建质粒的时候是N端、C端tagged同时分别构建，以备万一。
内源性蛋白的相互作用，主要依靠抗体IP，WB或者质谱分析。另外一条途径，是用外源性蛋白的coIP指代内源性蛋白，上文提到的tandem-tag技术的目的就是为了实现这种可能。它的核心是将外源性蛋白的过表达降低极低水平用于模拟体内环境。实际上，在构建外源过表达体系的时候，通常可以得到一系列表达水平差异的稳定单克隆，可以通过进一步筛选获得外源与内源相加与原内源蛋白水平相当的细胞株（在细胞调控承受的范围以内，内源性蛋白水平会因为相应的外源蛋白表达而适当下调），这样的细胞株可以用于模拟内源性蛋白的相互作用；因为理论上未改变细胞的生理特异，相应的生命过程仍受内源因素调控。
当然构建相应的细胞株需要转染并筛选，又因为要控制表达量水平，筛选工作耗时更长；并且细胞状态会因为传代过多而有些改变。因此，绝对的内源性蛋白的相互作用仍是一个不可或缺的数据，尤其对一个新发现的蛋白复合体。
IP内源性蛋白首先要确认相应的抗体是否能够用于IP。能够用于IP的抗体，通常其识别区域恰是天然状态下靶蛋白暴露于外的区段，常为疏水性结构域；因此在自己制备抗体的时候要更多考虑这个因素，至于商品化的要仔细阅读说明。
在确定抗体可以用于IP A蛋白以后，抗体投入量如何掌握呢？通常情况下0.1ug-3ug较常用（纯化的抗体），其变化取决于抗体的效价，但通常未知情况下0.5ug或1ug是最常用。一般如果样品易制备则尽量用样品过饱和抗体，让投入抗体能物尽其用；相反，通常1ug抗体已经是过量的。
另外一个需要考虑的因素是B蛋白的大小，尤其B蛋白已知。当B蛋白分子量接近55KDa或24KDa附近的时候，问题会比较复杂。因为在最后一步洗脱的过程，很容易将轻链和重链带入到IP终产物，它将严重干扰实验结果。
解决方案：
1. IP外源tagged-A蛋白，洗脱尽量用相应的peptide，一方面提高特异性，另一方面由于洗脱条件温和，重链和轻链脱落也会较少；在IP前，尤其对于新Flag、HA beads可以用washing buffer或者低pH Glycine-HCl漂洗一下beads，把结合不牢的重链和轻链先洗掉。此外，Flag、HA-beads通常是鼠抗，那么IB B蛋白的抗体应该选用兔抗。
针对beads的新旧，反过来说，采用再生的旧beads有利于避免轻重链的干扰，且IP前的封闭可以省去——不要指望高盐、酸洗能彻底去除已经非特异结合到beads上的杂质，通常这些蛋白都比较黏。高盐、大量纯化蛋白时，采用再生的beads可以获取即便银染，背景仍非常干净的高纯度蛋白样品。
2. IP内源性蛋白，尤其最后涉及低pH Glycine-HCl洗脱或者SDS LB煮beads（后者重、轻链更严重），如B蛋白为60KDa即能与55KDa重链分开时，且抗体效价许可的前提下，降低抗体投入量会显著减弱重、轻链信号，从而不会使得B蛋白信号不致被重链信号吞没；若有条件再配合交错抗体种属来源，即IP A蛋白的抗体为兔抗，IB B蛋白用兔抗以外任何一种诸如鼠抗、羊抗；反之亦然。即使交错抗体的种属，实际上当重轻链脱落过多时（尤其是重链），在IB的时候它符合《WB实战指南》提到的杂蛋白过浓会非特异结合任意抗体，这在coIP的实验结果分析中要格外小心。有人会说可以用未免疫的IgG做阴性对照，但是偶尔会发生一些未知意外，恰好IgG的重链没有显影（毕竟这不是抗原抗体特异性结合）。【BTW：偶尔这样的结果还能重复出来，但是反过来IP B蛋白，IB A蛋白可能就100%失败。所以，当蛋白分子量接近重、轻链的时候，下结论要格外小心，除严格阴性、阳性对照外，reverse IP的结果也很重要。最好加一个不相干的蛋白的同种属的抗体做阴性对照】
beads封闭和样品的preclear：
如果采用新beads，beads的封闭就显得非常必要。封闭用1-5mg/ml BSA（ChIP还要加鱼精DNA）扔buffer里一直静置就好了；若临时添加可考虑翻转半小时；样品preclear用protein A beads翻转半小时。实际经验，杂蛋白若是很黏怎么处理都只是相对好一些。所以，IP、漂洗的盐浓度影响更大。
coIP：
抗体剂量上文提过了；其他flag、protein A等等beads一般用10ul足够了，偶尔根据需要微调，诸如过表达纯化蛋白。总之，一般CE的成本较低，若用CE饱和抗体、beads，只要你抗体、beads和操作始终一致，最后IP的A蛋白能保证一致，结果有效。
干粉状的beads用IP buffer充分溶胀后离心去beads的碎片；其他液态的不需要此过程。现在市售的商品化beads如sigma flag可不需要IP buffer漂洗直接IP，未发现对coIP结果的明显干扰。通常，再生的beads由于放置-20度延长保存期需要加入大量甘油，不漂洗直接使用不容易把beads分匀，从而造成不同tube间初始差异，这时候会对IP结果影响很大。
用抗体做内源性IP时，个人喜欢抗体2hr+beads 1hr，抗体孵育可过夜；beads不超过3hrs（含flag等等标签蛋白IP情况）。这里面提到一个细节，就是先加beads还是先加抗体。在某些情况下，CE离心去除细胞碎片后的上清是一个刚好的溶解平衡体系，添加其他物质如beads这类可作为沉淀凝结核的物质会破坏原本的溶解平衡；它可能类似水蒸气凝结成雨水或雪花需要灰尘作为凝结核，其结果就是让一些原本溶解完全的蛋白发生沉淀。那么，beads翻转越久蛋白会沉淀越多，而这种沉淀无法靠漂洗去除干净，最终进入sample从而可以检测到任意蛋白的结合。因此，限制beads翻转孵育时间非常关键；通常beads孵育1-2hr已经充分结合了。
做IP的beads其物理性质跟吸附DNA的或诸如Ni-NTA之类的差异很大，不需要高速离心，通常台式小离心机4-5K、30sec就足够了；有时候忘记了，静置较久beads已自然沉降甚至不需要离心。在这种情况下，不必要的高速离心只会给beads施加巨大的离心力，次数多了beads通通碎裂，严重影响再生beads的质量——避免一些不必要的操作；当然不打算重复使用就无所谓了。
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