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标题: 嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结 [打印本页]

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作者: wwwkkk83    时间: 2017-3-13 10:10
标题: 嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）  
  （1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；

  （2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；
（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；
（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；  
（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。

   嘌呤霉素筛选稳定转染细胞  
（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/
孔的密度铺板，孵育过夜；  （2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；  （3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。）  （4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜；  （5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。 （6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；  （7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
  注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。

   储存方法和稳定性：   嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；  嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。

　 部分常见哺乳动物细胞的推荐工作浓度表

细胞名称	细胞类型	嘌呤霉素浓度
A549	Lung cancer	1-2μg/ml
B16	Mouse melanocytes	1-2μg/ml
ES cell	Human embryonic stem cells	0.5-5μg/ml
H1299	Non-small cell lung carcinoma	1-3μg/ml
HEK293	Human embryonic kidney	0.5-3μg/ml
HeLa	Human cervical cancer	1-2μg/ml
HepG2	Human hepatocellular carcinoma	0.5-2μg/ml
HT1080	Human fibrosarcoma	0.5-2μg/ml
MCF-7	Human breast cancer	0.5-2μg/ml
MDA-MB-231	Human breast cancer	0.5-5μg/ml
MEF	Mouse fibroblasts	1-5μg/ml

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作者: wwwkkk83    时间: 2017-3-13 10:33
   Puromycin是来源于Streptomyces alboniger的一种氨基核苷类抗生素，中文名为嘌呤霉素，常用于筛选通过质粒转染/转
化、病毒感染等方法能表达pac基因(puror)的真核或原核多克隆或单克隆细胞。Puromycin不仅用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。本产品的10mg/ml包装经过滤除菌，可以直接用于细胞培养。
      Puromycin的特点是快速作用于细胞，一般2天内可以杀死99%的不表达pac基因的细胞。
      在革兰氏阳性菌、动物或昆虫细胞中，嘌呤霉素通过抑制蛋白质合成而抑制或杀死细胞。其作用机制为嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3'末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素与A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
      Pac基因表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，该基因是在Streptomyces alboniger中发现的。如果表达基因，就会对嘌呤霉素产生抗性，这一特性目前普遍应用于筛选表达pac基因的哺乳动物稳定细胞株等。例如，很多商业化的慢病毒载体都携带pac基因(一般在质粒图谱上标记为puror)，从而利用嘌呤霉素筛选特定基因的稳定表达细胞株。嘌呤霉素也可以用来筛选表达pac基因的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。
     本产品10mg/ml包装配制在20mM HEPES(pH7.4)溶液中，浓度为10mg/ml，经0.22μm滤膜过滤除菌，可以直接用于细胞培养。本产品250mg包装为粉末装。




保存条件：
        -20℃保存，至少一年有效。10mg/ml包装避免反复冻融。
注意事项：
       本产品可能对人体有一定的毒害作用，请注意适当防护，以避免直接接触人体或吸入体内。
       本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
       为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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作者: wwwkkk83    时间: 2017-3-13 11:23
哺乳动物稳定表达细胞株的筛选
转染含有pac基因的质粒或者感染含有该基因的病毒后，即可筛选稳定表达株。
a. 细胞转染或感染48小时后，将细胞置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养，此为处理组。
注意：当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用最明显。细胞过于密集，抗生素产生的效力会明显下降，所以细胞的密度最好不超过25%。建议同时做一个正常细胞的对照组。转染或感染48小时后，如果细胞过密也可以消化后重新接种细胞，培养过夜后即可进行嘌呤霉素筛选。
b. 每隔2-3天，更换含有嘌呤霉素的培养基。
c. 筛选7天后，对照组正常细胞应该100%死亡，处理组中存活的细胞为表达pac基因的细胞。然后根据实验目的进行多克隆或单克隆细胞的筛选。
注意：每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要24小时，有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在2-10天。
d. 待细胞可以稳定生长后，嘌呤霉素的浓度可以减半用于后续的培养。在得到稳定表达细胞株后，一般建议嘌呤霉素也须持续加入，并2-3天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液。

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作者: wwwkkk83    时间: 2017-3-13 11:39
Suggested Puromycin Concentration

Cell Line	Concentration [µg/ml]	Reference
HT1080 (human fibrosarcoma)	0.2–0.4 1 2	J Biol Chem282:29314–29322 (2007) J Virol82:3320–3328 (2008) Cancer Res68: 1417–1426 (2008)
HeLa (human cervical cancer)	1-2 2 2	Genes Cells12:397–406 (2007) Mol Cell Biol28:4104–4115 (2008) PNAS105:16490–16495 (2008)
HEK293 (human embryonic kidney)	0.25 2 3	Nucleic Acids Res36:e83 (2008) Mol Cell Biol28:4104–4115 (2008) Mol Cell Biol 27:4708–4719 (2007)
Hep G2 (human hepatocellular carcinoma)	0.3 2 2	J Biol Chem283:21462–21468 (2008) Mol Cell Biol28:4104–4115 (2008) J Biol Chem283:708–715 (2008)
Human embryonic stem (ES) cells	0.5 1 5	Nucleic Acids Res 36:e148 (2008) Stem Cells26:850–863 (2008) Stem Cells26:2245–2256 (2008)
MCF-7 (human breast cancer)	0.45 1 2	RNA13:1375-1383 (2007) Cancer Res68:1319–1328 (2008) Mol Cell Biol28:4104–4115 (2008)
H1299 (non-small cell lung carcinoma)	1 1.5 2.5	Nucleic Acids Res 35:e17 (2007) J Biol Chem283:33394–33405 (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:1937–1942 (2008)
MDA-MB-231 (human breast cancer)	0.5 1.5 5	Mol Cell Biol28:997–1006 (2008) Mol Cell Biol 27:324 – 339 (2007) Mol Cell Biol 28:687–704 (2008)
A549 (lung cancer)	1.5 1.5	Mol Cell Biol 27:324–339 (2007) J Biol Chem283:33394–33405 (2008)

不同文献中某些细胞的作用浓度　　仅供参考

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