二、PCR 产物
两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连 T 载体再往下酶切连接。我个人强烈建议第二种，连 T 载体。 PCR 产物直接酶切有两个缺点：
1. 由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎。
2. 无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个或者十几个 bp，条带没啥变化。
连 T 载体的优点：
1. 进载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，再说 PCR 那东西还不太稳定，一把多一把少的。
2. 酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。连 T 载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟 T 载体上自带的切点冲突，这就要小心鉴别。而且连 T 载体最好测序看一下 PCR 的产物对不对、切点对不对。总体来讲连 T 载体是很有优势的。
四、酶切用于连接的酶切很关键。 需注意如下几点：
1. 如果是双酶切 A 和 B，预实验中必须做 A 和 B 各自的单酶切和 A+B 的双酶切，务必确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。如果切不开就要考虑是不是酶的问题，buffer 的问题，质粒上有没有这些切点，序列是否甲基化等。尽量选实验室常用的内切酶。
2. 酶切尽量用大体系，如 50 uL、100 uL 等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。相反，连接尽量用小体系，以增加 DNA 末端的碰撞机会。
3. 如果要回收、连接，酶切用的 DNA 量不用太大。大了会切碎，形成一些不规则的末端，不利于连接。
4. 酶切后的电泳，即切胶的那次电泳中，如果切成的条带很清晰，不拖泥带水，没有弥散，没有拖尾，那做回收、连接效果最好。相反，若有弥散、拖尾、不清楚、一团亮等情况就是切的不好，做后续实验成功率会降低。若真是效果很差建议改进体系重新切。
五、回收
回收可以用柱式试剂盒或手工法。 柱式回收试剂盒：此类试剂盒适合各种长度 DNA，对黏性末端基本没有破坏，回收效率也不错。 手工醇沉淀法：步骤如下，把切得的胶弄碎，用 Tris-HCl 浸泡一段时间，吸出所有的液体，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加盐和醇醇沉，沉淀用 70% 乙醇漂洗，再用 Tris 溶解。这个方法的优点是对 DNA 和黏性末端的损伤最小，缺点是容易损失 DNA。若本来 DNA 数量就不多，用手工法很容易丢失殆尽。如果 DNA 量很大可以考虑使用。
回收后要跑电泳，一来估算回收液浓度，二来看回收 DNA 的质量。若条带有弥散，即自目的条带以下有拖痕，不是清晰利落的一条带，则质量不好。因为条带拖痕表示它已碎裂成比它小的各种长度的片段，而主带虽然还在那个位置但也已遭到一定程度的破坏。质量不好的回收产物做连接成功率会降低，假阳性克隆会增加。造成回收质量差的原因可能是回收这步，也可能是酶切那步，如果酶切那步出现酶切中所描述的情况，就容易造成回收质量不好。只有回收到清晰、利索的条带，才不影响连接。
七、连接
最后才轮到连接。连接的问题讨论的是比较多的。如果前述若干步骤所得产物质量好，连接不会很难。
1.DNA 的量：DNA 总量有几十 ng 就能连接成。当然如果你的 DNA 质量好 DNA 用量越大连接效率越高。就怕你为了追求 DNA 数量而降低了质量，那可就得不偿失了。
2.vector 和 insert 的比例：如果 insert 不长（2 kb 以下）、vector 是 insert 的几倍长，可以用 1：3～1：9。如果 insert 较长（3～4 kb 以上）、vector 和 insert 长度相似或 insert 比 vector 还长，可以用 1：1～1：3。短片段的连接相对容易，做的好可以挑到好多正确的克隆。长片段的连接效率较低，阳性克隆率小于等于 10% 是很正常的。我做过一个长片断的连接，6 k 的 vector、6 k 的 insert，比例用 1：1，挑了 20 个克隆有一个对。
3. 体系体积：通常用 20 uL 都能连上，若连长片段可以压缩成 10 uL（前提是 DNA 数量不变）。我觉得体系不是很关键，有位很精通克隆的老师说他都用 50 uL 体系，照样百发百中。而且如果你的 DNA 是用 EB（即 Tris）溶解的，体系中不加水也行。前述我自己连的长片段也是用 20 uL 体系，vector 和 insert 各上 8 uL。