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标题: 呼吸道合胞病毒空斑实验方法汇总 [打印本页]

作者: 病毒云 时间: 2017-8-10 20:46
标题: 呼吸道合胞病毒空斑实验方法汇总
本帖最后由病毒云于 2017-8-10 20:47 编辑

传统的空斑实验方法测呼吸道合胞病毒的pfu值,由于其空斑形成较小,且需要借助特异性的表面融合蛋白抗体来确定,故操作繁琐,费用较高。这里介绍给大家两种简单易行的空斑形成实验操作方法：
方法一：
1. 以5×10e5/ml的密度接种Hep－2细胞到6空板中，每孔加入3ml细胞悬液；
2. 待细胞长成单层后（不得超过48hr），移去营养液，每孔加入400ul的PBS和100ul毒液（10倍系列稀释）；
3. 37度，5％CO2，吸附1-4hr，每隔15－30分钟应摇晃板子1次以令病毒分布均匀，病毒在4h时达到最高吸附度；
4. 弃去吸附液，每孔添加覆盖层3ml，少于3ml细胞不易存活。覆盖层以含5％小牛血清的2×DMEM和0.6％的琼脂糖按1：1比例混合而成，这样小牛血清的终浓度为2.5％，琼脂糖为0.3％。琼脂糖必须高压灭菌，用前以微波炉充分融解，并放置65度水浴保温待用。2×DMEM即取1袋干粉DMEM加入500ml去离子水融解即可，其中还可加入双抗或二性霉素等，过滤除菌备用，用时37度预热。二者应充分混合温度不能过高（即无手感为止），否则会摧残细胞；
5. 37度孵育6－7天，到时每孔添加约2ml的1％福尔马林（以0.15M的NaCl配制），固定过夜使之充分渗透过覆盖层。固定时间24hr以上，无上限；
6. 剔除覆盖层，用自来水轻柔的冲洗平板边缘残留的琼脂糖；
7. 每孔添加2－3ml的0.05％中性红。贮存液为10×的，可保存数月之久，工作液以去离子水稀释即可；
8. 室温染色1h－1d，吸掉染液，轻柔地清洗并打开盖子令其干燥后即可保存数年之久；
9. 空斑计算方法同其它方法。
参考文献：Jennifer L. McKimm-Breschkin, A simplified plaque assey for respiratory syncytial virus- direct visualization of plaques without immunostaining, J. Viro Methd. 120(2004) 113-117

作者: 病毒云 时间: 2017-8-10 20:48
方法二：
1、以5×10e5/ml密度接种Hela细胞于12孔板中，每孔1ml，使之24hr内能长成单层；
2、以2％DMEM（维持液）10倍系列稀释好毒液；
3、吸去生长液，PBS洗涤细胞1－2次，每孔加入维持液500ul；
4、每孔加入稀释好的毒液50ul，充分混匀，每个稀释度做2个复孔，37度，5％CO2吸附2h，每隔5分钟摇晃1次平板，以使之分布均匀；
5、微波炉充分融化无菌的3％琼脂糖，65度水浴保温备用，4％的2×DMEM预热至37度；取1个小培养瓶，分别加入等体积的琼脂糖和DMEM，充分混合至温度适合时每孔加入混合液1ml；
6、室温或4度放置板子致覆盖层完全凝固，然后将之反扣过来，置37度培养4－5天，每天观察细胞情况，注意保证培养箱内有保湿的蒸馏水，否则琼脂糖易干裂；
7、取出板子，每孔加入100ul的MTT，37度孵育4h，则可见清晰的空斑形成，活细胞染成蓝色，选择空斑不融合且分散单个的空斑计数计算pfu值即可。MTT即塞唑兰，100mlDDW加入250mg配成0.25％浓度，-20度冻存备用；
8、pfu计算方法同其它。
参考文献：见重庆医科大学儿童医院免疫室廉国利博士论文《脱氧核酶在小鼠体内抗呼吸道合胞病毒的效应》

作者: 病毒云 时间: 2017-8-10 20:48
方法三：
1、试验前一天用2 ×105HEP22 细胞接种24 孔板。37 ℃,5 % CO2 培育过夜。Hanks 液冲洗细胞1～2 次,用NaHCO3 调Eagle MEM的pH 值后稀释RSV(10 倍稀释) ,然后加入24 孔板中(设2个复孔) ,吸附1～2 h ,15～30 min 摇动一次以保证
蚀斑分布均匀。
2、以2 倍的Eagle 内加青链霉素、卡那霉素、碳酸氢钠、琼脂糖配成琼脂覆盖层。
3、倒出病毒液,加入琼脂覆盖层0.5 ml ,冷凝后,倒置于34 ℃,5d 后,用福尔马林固定,015 %结晶紫染色。显微镜下数斑。
4、PFU = a1b/ v ( PFU 指每ml 病毒样品空斑形成单位,a 指空斑均数,b 指病毒稀释度的倒数,v 指病毒量。
参考文献：邹毅，黄海鹭，徐军，钟南山；小鼠的原发性呼吸道合胞病毒感染；中华结核和呼吸杂志2001 年8 月第24 卷第8 期。

作者: 病毒云 时间: 2017-8-10 20:48
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