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标题: 流感病毒噬斑+++求助 [打印本页]

作者: bestar 时间: 2015-5-27 22:38
标题: 流感病毒噬斑+++求助

我用MDCK细胞做流感病毒的噬斑纯化，可是中性红染色后，细胞都没有染上色？？
中性红配方：0.2g+100ml超纯水，研磨后过滤并高压，避光4度保存
第二层琼脂配方为 2倍4%血清DMEM培养基：1.6%低熔点琼脂：0.2%中性红=9：9：1（中性红終浓度为1/10000=0.01%）
请高手指点！！！不胜感激！！！

小朝 http://biosky.haotui.com/thread-30954-1-3.html

作者: bestar 时间: 2015-5-27 22:38

我一直在做如你所说的实验。。一方面，我做噬斑纯化不染色。看到斑后直接挑。另外，我做噬斑用的病毒维持液和琼脂稀释液是不加血清的，用2% BSA代替，琼脂浓度是1%。。

lzwangjf

作者: bestar 时间: 2015-5-27 22:39

2倍4%血清DMEM培养基。-问题可能出在这里。
一般没有多碱性裂解位点的病毒，必须添加TPCK-Trpsin（0.5%终浓度）。所以不能用含有血清的培养基。可以用终浓度0.3% BSA 代替血清。 MDCK很容易培养不需要高营养的。

饰板纯化我没听说过要染色才能挑斑，一般3天左右斑长的很大了，对着光线先在做个标记，然后用tip 头挑就行了。染色一般用结晶紫，活细胞呈蓝色，斑就显示空洞，一般是为了好计数。
楼上的问题是斑长的太小，还是在这里想办法吧。
如果觉得实在不好做，你可以用有限稀释法纯化3代也可以。

极乐净土

作者: bestar 时间: 2015-5-27 22:40

2倍4%血清DMEM培养基。-问题可能出在这里。
一般没有多碱性裂解位点的病毒，必须添加TPCK-Trpsin（0.5%终浓度）。所以不能用含有血清的培养基。可以用终浓度0.3% BSA 代替血清。 MDCK很容易培养不需要高营养的。

饰板纯化我没听说过要染色才能挑斑，一般3天左右斑长的很大了，对着光线先在做个标记，然后用tip 头挑就行了。染色一般用结晶紫，活细胞呈蓝色，斑就显示空洞，一般是为了好计数。
楼上的问题是斑长的太小，还是在这里想办法吧。
如果觉得实在不好做，你可以用有限稀释法纯化3代也可以。

极乐净土

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