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标题: 急！救助Sf9细胞转染问题 [打印本页]

作者: virology 时间: 2015-7-8 10:09
标题: 急！救助Sf9细胞转染问题
原贴由nk0401发表于 2010-8-9 11:28
http://biosky.haotui.com/thread-16069-1-6.html

本人最近再做转染。Bacmid是按照英俊说明书上手提方法提取的，溶液1,2,3等。
请问 1、提取1.5ml菌液的量够吗？
   2、最后溶解时候用水好还是TE好？这样提出的DNA需要在纯化吗？我担心抑制转染效率。
   3、转染我用Cellfectin，基本按照说明书做的。
      请问细胞贴壁15min是不是时间有点短？
      说3- 5h后换液，我试过6h和12h，目前还看不到病变，请问这个时间需要摸索吗？
      说是1微克DNA和100微升无添加Grace混合，DNA的量怎么掌握？

      我刚接触这个，问的问题可能不专业，希望大家给我点意见或建议，谢谢!

以下为会员回复:
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stare024 于 2010-8-9 12:10 :
转染贴壁细胞，以细胞贴壁完全，状态良好，密度合适为宜。不要拘泥于说明书上的时间。
加入细胞悬液15min后，有可能状态好，可以进行转染，
也有可能状态不好，最好不要转染。
提完DNA后转染都是要测浓度的，只要DNA足够量就可以。
你1管也是抽，2管也是抽，3管也是抽，干嘛一次抽一管，一次多抽点儿以备不测嘛。
用水溶解最好。

daniel 发表于 2010-8-9 12:22 :你的质粒的浓度和纯度都要达到要求，细胞状态和密度等都要在很好的状态下，我感觉你的DNA浓度不高，而且纯度不纯，都会影响你的转染效率，你转染的时候要测你质粒的浓度和纯度，才能掌握DNA的量。
我做转染的时候是前一天细胞铺板，第二天做转染，5h后换全培，有时候病变出的时间要在5-6天，其它条件还是要慢慢摸索，别着急，会转染成功的。

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nk0401 发表于 2010-8-9 15:28 :
To 2# stare024

我上次是抽了3ml，测的浓度是1微克/微升，260/280是1.98。转染的说明书是要求1微克，我试了1，2，3微克，换液时间有6h的，也有12h的。目前已经转染了2天了，没有什么变化。

nk0401 发表于 2010-8-9 15:32 :
To 3# daniel  DNA的浓度是1微克/微升，260/280是1.98。我也担心15min时间不够，而且每次铺板后上面会有不少死细胞漂浮。请问你提前一天铺的话，铺多少细胞合适？比如6孔板。转染时候细胞大概有多少了？

作者: virology 时间: 2015-7-8 10:12
158584843 发表于 2010-8-9 17:06 :如果第一次转染，到5天没看到病变，可以收集上清再接毒，看看有没有病变！盲传2次看看，再就PCR鉴定一下！

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daniel 发表于 2010-8-22 13:36

CR鉴定是否转染成功，需要提取上清中杆状病毒的DNA来进行鉴定

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wangting0823 发表于 2010-10-25 13:49 :我也正准备做sf9的转染，用的是invitrogen的cellfectinII
这里大家提到的病变和盲传是什么意思啊
PCR鉴定是怎么做呢？模板、引物之类的有什么特别吗
转染新手，请各位大虾赐教

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恋沙发表于 2010-11-7 18:17 :我使用的是Invitrogen的Bac to Bac 转染系统，我们实验室的做法如下：

1.用3mL的LB抽取bacmid后，使用Target DNA 的上游引物+M13R进行PCR验证
2.验证成功后，用150mL的LB大抽Bacmid，使用TE进行溶解，转染时的使用量为2ug
3.我们使用的是Roche的转染试剂，sf贴壁时间为1h，然后4~5h后进行换液

希望对你有所帮助~~

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