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标题: 认识杆状病毒连载之三：杆状病毒生物杀虫剂 [打印本页]

作者: virology 时间: 2015-7-8 11:05
标题: 认识杆状病毒连载之三：杆状病毒生物杀虫剂
原贴由stare024发表于 2011-2-10 10:00
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      3 杆状病毒作为昆虫生物杀虫剂
      当前农产品安全形势面临的最大挑战是农药残留问题，化学杀虫剂的长期大量使用不仅导致害虫产生抗药性，还容易引发环境污染，对人类的健康形成了巨大的威胁。在自然条件下，许多微生物可以侵染昆虫并引发昆虫疾病，这对调控昆虫的种群数目有着十分重要的作用。利用昆虫病原微生物来防治害虫在生物防治中占有重要的地位，其中昆虫杆状病毒(Insect Baculovirus)由于宿主专一、致病力强、传播迅速、无残留、无抗性、对脊椎动物和植物安全等特点受到人们的广泛重视。
      3.1 昆虫杆状病毒在害虫防治中的应用
      传统的利用杆状病毒防治害虫的方法是引入有效的杆状病毒。既将杆状病毒引入害虫的高发区，使得病毒在害虫间迅速传播，对害虫起到有效的防治作用，同时杆状病毒可以长期存在于当地的生态环境中，对下一代及以后年份的害虫有一定的防治作用，起到对害虫的种群密度起到长期的自然调控作用。20世纪30年代，欧洲杉云蜂(Spruce sawfly，Gilpinia hercyniae)在加拿大东部活动猖獗，对云杉林木造成巨大的危害。人们在从欧洲斯堪的纳维亚半岛引进天敌，以达到以虫治虫的目的。与此同时，一种欧洲杉云蜂的核型多角体病毒也随天敌昆虫一起引进到了加拿大，这种病毒开始在杉云蜂中传播，并成功的控制了杉云蜂的数目，阻止了其对云杉林木的危害[44]。而之后的几十年里，该种病毒一直存在于当地的森林生态环境中，使欧洲杉云蜂的种群数目一直被控制在经济阈值限以下，而不需要任何其它的防治措施。
      除此之外，利用活体昆虫大量繁殖病毒是目前比较普及的方法。通过在活体昆虫和宿主的细胞组织中大量繁殖，而后在害虫爆发之前释放到田间和森林中，以达到防治害虫的目的。
      在巴西，黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)给当地的大豆种植带来很大的危害，从上世纪80年代开始，黎豆夜蛾核型多角体病毒(Anticarsia gemmatalis NPV，AgNPV)就被应用于黎豆夜蛾的防治[45,46]，到2005年为止，AgNPV应用的面积大约在200万公顷左右[47]。在中国，棉铃虫核型多角体病毒(Heilicoverpa armigera  NPV，HearNPV)也被广泛的应用于棉铃虫的防治[48]。除上述两种杆状病毒外，目前国内外已有多种杆状病毒注册并生产成制剂，商品化投入市场[44](表1.1)，并且有许多专门从事杆状病毒杀虫剂研发的公司，如Du Pont，Certis USA，Agrivivion，河南济源白云实业有限公司，武汉武大绿洲生物技术有限公司等。

表 1.1 目前世界上商品化注册生产的杆状病毒杀虫剂

Table 1.1 Commercial insect baculoviruses products in the world
产品名称，生产公司，杆状病毒种类，  防治对象，  宿主作物；
Spod-X ， Certis USA (美国) ，甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeMNPV)，甜菜夜蛾，花卉；
GemStar，Certis USA (美国)，玉米夜蛾核型多角体病毒(HasNPV)，棉铃虫，棉花、玉米、高粱、大豆、番茄、烟草；
Cyd-X， Certis USA (美国)，苹果小蠹蛾颗粒体病毒(ArGV)，苹果蠹蛾，核桃、苹果、桃、梅；
Elcar，Syngenta(美国)，玉米夜蛾核型多角体病毒(HasNPV)，棉铃虫，棉花、玉米、高粱、大豆、番茄、烟草；
Madox，Andermatt Biocontrol(瑞士)，苹果小蠹蛾颗粒体病毒(ArGV)，苹果蠹蛾，核桃、苹果、桃、梅；
Granusal，Behring AG Werke(德国)，苹果小蠹蛾颗粒体病毒(ArGV)，苹果蠹蛾，核桃、苹果、桃、梅；
Caprovirusine，NPP(法国)，苹果小蠹蛾颗粒体病毒(ArGV)，苹果蠹蛾，核桃、苹果、桃、梅；
Mamestrin，National Plant Protection (法国)，甘蓝夜蛾核型多角体病毒(MbNPV)，菜蛾、小菜蛾，棉铃虫、蔬菜；
VPN，Agricola ElSol (巴西)，黎豆夜蛾核型多角体病毒(AgNPV)，黎豆夜蛾，大豆；
Gusano，Certis USA (美国)，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)，苜蓿银纹夜蛾，苜蓿；
Spodopterin，National Plant Protection(法国)，秋粘虫核型多角体病毒(SfNPV)，秋粘虫，棉花、蔬菜；
Disparvirus，Corporation CCIP INC(加拿大)，舞毒蛾核型多角体病毒(LdNPV)，舞毒蛾，森林植物；
Polygen，Multigen Aggrogen(巴西)，黎豆夜蛾核型多角体病毒(AgNPV)，黎豆夜蛾，大豆；
科云系列，河南济源白云实业有限公司(中国)，棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)，棉铃虫，棉花、番茄；
科云系列，河南济源白云实业有限公司(中国)，斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpliNPV)，斜纹夜蛾，蔬菜；
棉核·苏云菌，武汉武大绿洲生物技术有限公司(中国)，棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)，棉铃虫，棉花、玉米、蔬菜；
茶尺蠖NPV原粉，武汉武大绿洲生物技术有限公司(中国)，茶尺蠖核型多角体病毒(EcobNPV)，茶尺蠖，茶叶；
      3.2 重组杆状病毒杀虫剂的研究
      虽然杆状病毒杀虫剂的应用越来越多，但是与传统的化学农药相比来说，昆虫杆状病毒作为杀虫剂在害虫防治上也有一定的局限性。主要表现在两个方面。其一，杀虫速度慢，一般幼虫感染病毒到死亡需要1-3周的时间，在此期间害虫可能还会造成一定的危害，这就导致许多商品化的昆虫杆状病毒制剂只适用于那些能够承受一定程度的叶片损害而不导致经济损失的植物。其二，杀虫谱窄，在害虫防治过程中，人们总是希望能够使用一种杀虫剂来防治某一作物上的所有害虫。虽然有些核型多角体病毒(如AcMNPV)能感染多种害虫，但是在防治效果上往往是大打折扣。
      为此，科研人员通过改造杆状病毒，鉴定并去除某种非必需基因来增加杀虫效果，或插入某些昆虫选择性毒素基因以提高杀虫速度，或通过修饰、缺失与宿主范围相关的基因来拓宽病毒的杀虫谱，以此增强杆状病毒的致病力，缩短杆状病毒的潜伏期，扩大杆状病毒宿主范围，为开发新一代的杆状病毒杀虫剂提供了广阔的前景。
      3.2.1 删除杆状病毒某些基因构建重组昆虫病毒
      通过删除杆状病毒的基因组中存在某些与病毒DNA复制无关的非必需基因，可以提高杆状病毒的杀虫活性，如蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因(Ecdysteroid UDP-glucosyl trandferse gene，EGT)。egt基因编码的酶通过把葡萄糖和半乳糖连在蜕皮甾类激素的c-22位羟基上而抑制其活性，从而抑制昆虫的蜕皮化蛹，延长虫期，有助于病毒的大量繁殖，却给作物带来很大的损害[49]。
      O′Reilly等[50]首先构建出缺失egt的AcMNPV，被病毒感染的宿主停止取食提早进入蜕皮状态。与感染野生型AcMNPV的幼虫比起来，感染egt基因缺失的重组病毒的幼虫食物消耗量减少40%，体重减轻，致死速度加快了30%。James等[51]构建了缺失egt的舞毒蛾核型多角体病毒(LdNPV)，感染5龄舞毒蛾试验表明，致死速度较野生型LdNPV显著加快，由于5龄幼虫对作物破坏最大，因此，该重组病毒能为作物提供更好的保护。Sun[52]等在感染egt基因缺失的玉米夜蛾核型多角体病毒108h后，幼虫对植物的消耗量比感染野生型玉米夜蛾核型多角体病毒的幼虫要减少50%。美国环境保护署(U.S.Environmental Protection Agency)在1993年批准了第一个重组病毒缺失egt的AcMNPV用于田间释放试验[53]，改造egt基因的编码区域，使egt失活是应用基因工程生产高效杆状病毒杀虫剂的一个发展方向。
      除了egt外，删除AcMNPV pp34 基因编码的多角体膜蛋白(Polyhedral envelope protein) 可以提高病毒的毒力。pp34 基因是AcMNPV所独有的一个基因，该基因表达的蛋白是构成多角体膜的主要组分。Zuidema等[54]用插入失活法破坏这一基因后，病毒多角体外周不存在膜状结构，而病毒的感染性有所提高。pp34基因缺失病毒对寄主感染性提高的原因，可能与该病毒的病毒粒子更容易从多角体中释放有关。
      3.2.2 插入昆虫激素构建重组昆虫病毒杀虫剂
      近年来许多科研人员利用插入外源基因来改造野生型病毒，通过在强启动子下游插入一些可以调控昆虫发育的激素基因或昆虫特异的神经毒剂来构建重组病毒杀虫剂，使之高效表达，从而提高杀虫速度、缩短杀虫时间，同时能减少害虫对病毒的抗性。
      昆虫利尿激素(Diuretic Hormone，DH)在昆虫的水分平衡和代谢中有着十分关键的作用，当其在昆虫体内过高时，会扰乱昆虫的自然水体平衡，导致昆虫停止取食而死亡。1989年，Kataoko等[55]从烟草天蛾中分离出利尿激素并确定了其氨基酸顺序，同年，Meada[56]人工合成了烟草天蛾利尿激素，并将其基因插入到BmNPV 基因组，成功构建了表达利尿激素的重组病毒。当把该病毒接种家蚕后，成功地在家蚕体内获得高效表达，并且由于过量的异源利尿激素扰乱了蚕体水分平衡，使病毒致死时间缩短20 %。
      昆虫保幼激素(Juvenile Hormone，JH)是一种重要的变态激素，在昆虫幼虫各个龄期都维持较高的浓度以保持昆虫处于取食状态。保幼激素酯酶(Juvenile Hormone Esterase，JHE)通过降解保幼激素，使得昆虫蜕皮化蛹。由于天然的保幼激素酯酶在围心细胞内的溶解酶作用而降解，Bonning等[57]将表达改良的保幼激素酯酶的重组杆状病毒注射到烟草天蛾的幼虫体内后，与野生型杆状病毒相比，重组病毒可以减少50%的取食量。
      3.2.3 插入昆虫特异性毒素构建重组昆虫病毒杀虫剂
      第一个被引入杆状病毒表达的神经毒剂是蝎(Buthus eupeus)毒液中一个表达毒素蛋白的基因(BeIT)。Carbonell等将BeIT插入到AcMNPV的基因组中，构建了重组杆状病毒，但令人失望的是，BeIT毒素并没有改善重组病毒的杀虫效率[58]。目前，常用的神经毒剂是北非蝎(Androctonus australis)的毒素基因AaIT。Stewart等[59]将AaIT插入到AcMNPV基因组中，使其受p10基因启动子的控制，并在其5’端接有AcNPV的gp64基因信号肽序列，经过粉纹夜蛾二龄幼虫生物测定，重组病毒的LT50为85 h，比野生型病毒缩短28h，降低30%，对甘蓝的危害减少50%。
      昆虫神经毒素LqhIT2是一种从以色列黄蝎Leiurus quinquestriatus hebraeus (Ehrenberg)的毒液中分离得到的昆虫长链神经毒素[60]，成熟毒素由61个氨基酸残基组成，有较强的抗虫活性，具有控制农业害虫的重要潜在应用价值。Harrison 等用AcMNPV的p10和p6.9启动子在薄荷灰夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒(Rachiplusia ou multiple nucleopolyhedrovirus，RoMNPV)中分别表达了AaIT和LqhIT2，对欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的防治效果显示，表达LqhIT2的病毒杀死速度明显比野生型快[61]。Regev等近一步研究表明，相对于毒素的单独表达，LqhIT2和LqhIT1的联合表达效果最佳，ET50仅为46.9h，比野生型提高40％，比毒素独立表达分别提高了18％和22％[62]。
      3.2.3 修饰病毒基因组中特定的基因以扩大宿主域
      昆虫病毒对宿主的专一性决定了其只能感染特定的一种或几种宿主，一定程度上限制了杆状病毒的应用。研究显示，昆虫病毒对宿主的专一性主要取决于病毒基因组在宿主细胞内的复制和晚期基因的表达[63]。目前已知影响杆状病毒宿主的基因有p143，p35，hrf-1等[64]。
      研究结果表明，AcNPV中P143基因编码的DNA解旋酶能够扩展AcNPV的宿主范围。1991年，日本的Kondo等[65]用AcMNPV与BmNPV共转染Sf21细胞系(BmNPV的非受纳细胞系)，得到能在这两种细胞系中均能复制增殖的重组病毒；Maeda等[66]用重组病毒与AcNPV反复回交产生了eh-AcNPV，限制性酶切图谱分析发现，决定AcNPV宿主范围的DNA位点是在编码DNA解旋酶基因区内。Croizier等[67]经过进一步研究，确定AcMNPV宿主域的改变是该基因区内一个79nt序列决定的。在这79个核苷酸序列中，AcMNPV和BmNPV在6个位点上存在不同，相应的是4个氨基酸的替换。即通过AcNPV基因组DNA与凝胶纯化的BmNPV基因组DNA p143基因的PCR产物共转染实验表明，将AcNPV基因组的三个特有的氨基酸用BmNPV基因组p143蛋白相应的氨基酸替换，可以将AcNPV的宿主扩展到家蚕。
      Thiem等[68]通过研究，在舞毒蛾核型多角体病毒(LdMNPV)中发现了编码一个富含谷氨酸和缬氨酸的蛋白基因，该基因能使得AcMNPV在不敏感的细胞系IPLB-Ld652Y中复制，并命名为宿主改变因子1(host range factor 1，hrf-1)，经Southern blot分析，该基因很有可能是LdMNPV所独有的一个基因。近一步的研究发现[69]，hrf-1也可以使美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea NPV，HcNPV)、家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NPV，BmNPV)、甜菜夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera exigua MNPV，SeMNPV)在不敏感的细胞系IPLB-Ld652Y中复制。
      虽然以上的研究足以说明通过基因修饰或者重组可以产生宿主域扩大的重组病毒，但是由于其具体的机制目前还不清楚，要在重组杆状病毒杀虫剂中得以应用，还需要更深一步的研究。

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