导 读
利用CRISPR技术中两个Cas蛋白可结合于特定的目标序列的特点，建立了新型病毒检测技术，通过基因编辑技术进行病毒检测具有经济、简便且高灵敏的优点。近日，杜克大学生物医学工程系和基因组及计算生物学中心的Dewran Kocak 和 Charles A. Gersbach发表专栏文章“From CRISPR scissors to virus sensors”，并刊发于国际著名期刊Nature杂志。
背景介绍
病毒感染者的病毒载量多数情况下较低，如在寨卡病毒爆发时，感染个体的血液中病毒量仅为1个copy/μl。如此低的病毒拷贝数给临床诊断带来很大限制。Science杂志曾分别报道了3个研究小组的基于基因编辑技术病毒检测技术。
CRISPR 系统，来源于酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes），已被改良为一个基因编辑工具，它正在变革传统的生物医学研究。不同种类的CRISPR系统，都有其特定的特征。本文的涉及的三个研究团队所使用CRISPR系统虽各有特点但也有共性：宿主基因组中整合有感染的病毒基因。当病毒再次感染时， Cas 酶活性启动，并可结合并裂解目标核酸序列（collateral activity）。由此利用这个活动作为一个检测信号放大器和检测分子信标（ Beacon ）。
第一篇研究论文
Chen等研究建立了基于Cas12a蛋白的V型CRISPR系统。研究发现了Cas12a在结合于它特异的双链DNA目标之后，可任意地劈开单链DNA（collateral activity）。由此建立了可用于检测DNA病毒的一个诊断的工具。Cas12a向导序列被设计用于匹配病毒DNA上的特殊目标。在结合于一个病毒的目标后，Cas12a切开“报告基因”（一个末端被一个荧光分子标记，另一端被一个淬火分子标记的一个单链DNA分子）。切开之前，荧光基团发出的荧光被淬火分子捕获。然而，在单链DNA被Cas12a切开后，荧光可以很容易地检测到（图a）。为提高荧光检测信号的灵敏度，研究团队借助重组酶聚合酶扩增（RPA）技术扩增目标病毒DNA，如此可比在最初的标本中产生更多的目标拷贝。
第二篇研究论文
Gootenberg 等将先前的工作扩展，创造了一个称为SHERLOCKv2 的诊断法（specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking version 2) 。SHERLOCK最初的版本，与Chen的研究相似，但使用Cas13，它可结合并酶切RNA，而不是DNA[5]，SHERLOCK 并不局限于RNA检测，因为可在RPA过程中，加入一个转录步骤，使得病毒的DNA转为RNA[6]。Gootenberg 团队从几个方面改进了SHERLOCK。如，他们筛查17个Cas13家族成员，全面解析其活性，并通过使用4个不同Cas13蛋白，创新性建立了可以同时检测四种病毒的SHERLOCKv2系统，灵敏度可达每毫升样本2病毒基因组拷贝。研究者还发现Cas13的分裂产物可以激活另一个Cas蛋白——Csm6。通过包含一个附加的单链RNA构造，它能被活化的Csm6劈开（图1.b）。研究组提高了与背景有关的信号，且改进了SHERLOCKv2反应的动力学。最后，作者们组合这些结果开发出一个更为简便的试验：将一滴样本保存一张试纸上即可后续检测，如此可便于临床的扩大应用。
第三篇研究论文
由Chen等和Gootenberg 等研发的技术都要求严格的纯化步骤，来预防病毒被身体的RNA消化酶在实验中降解。而在该篇论文中，Myhrvold等综合先前报道的SHERLOCK版本和引入采取酶失活技术，如此可直接在尿和唾液中检测病毒。病毒的基因组能快速地变异，但是Myhrvol研究组声称可以其方法可以区别相差一个单独核苷酸变异的序列。如，可以用其方法鉴定分离于不同地理区域的寨卡病毒毒株，以及携带与头小畸形有关的一个突变的寨卡病毒。整个实验流程可在2小时内完成，且对设备和样品的标准要求较低。
结 语
CRISPR技术的兴起，目前主要集中于它在基因或细胞治疗上的使用，但费用昂贵的，在可预知的将来，也许只能在世界的富裕地区得到使用。而当前的研究，简便、经济、实用，如此将极大地使CRISPR技术的可能受益者扩大和多样化。
Scissors become sensors.pdf
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