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标题: [转移贴]想向各位前辈请教一下关于PCR产物纯化与测序问题 [打印本页]

作者: cao1976 时间: 2015-7-20 12:10
标题: [转移贴]想向各位前辈请教一下关于PCR产物纯化与测序问题
原贴由minister发表于 2009-8-29 10:20
http://biosky.haotui.com/thread-11511-1-7.html

想向各位前辈请教一下关于PCR产物纯化与测序问题。

我看到了有两个方案：

1.PCR扩增产物经过电泳，割胶后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA回收纯化，送至华大基因测序。

2.扩增产物回收纯化后与PMD-18T载体连接，筛选阳性克隆，经过双酶切鉴定后进行序列测定。

我的PCR产物就单一的一条带，大约500bp吧，先用的是方案1，华大测序结果正常，但是我想问一下为什么很多人发PAPER都写方案2啊？

为什么呢？:~)有什么好处呢？

作者: cao1976 时间: 2015-7-20 12:12
jbclinnic 发表于 2009-8-29 11:39 ：
扩增片段一样，但是很可能存在变异
比如，很多病毒是混合侵染，得到的PCR产物就是多态性混合的产物
直接回收不能避免此类情况。

作者: cao1976 时间: 2015-7-20 12:12
wjg_1979 发表于 2009-8-29 12:13 ：

两种方案：一种是用克隆载体的，另一种是不用克隆载体的．两种有什么区别呢？
区别在于不用载体的是直接用ＰＣＲ产物测序，这种是用ＰＣＲ扩增引物来测序，通常这样的测序结果前100 nt是不准确的或是不可靠的，同时，这样还会另一个问题就是测不出结果，因为测序引物的要求较ＰＣＲ扩增引物要高些．除非是你要的序列不包括前100-150nt序列，否则，不建议直接用ＰＣＲ产物测序．而连接上载体后可克服这些问题．另外，克隆质粒易于保存，以便以后用得着，而ＰＣＲ产物保存较易降解．结上所述，Paper中都是用作者所说的第二种方案．

作者: cao1976 时间: 2015-7-20 12:13
123qsz321发表于 2009-8-30 11:12 ：
PMD-18T载体连接以后这种带有目的片段的质粒可以保存并且可以为后续试验提供保障例如你要做目的片段的蛋白表达前期的工作就是验证你的片段得到测序结果确保没有突变为下一步表达载体的构建提供保障因为PMD-18T载体是比较便宜购买的较好的表达载体是有点贵所以需要前期的验证和保障试验的顺利说的有点啰嗦本人陋见

作者: cao1976 时间: 2015-7-20 12:14
stare024 发表于 2009-8-30 12:36 ：
同意楼上。克隆到载体上便于以后的实验操作。
克隆到质粒上便于保存，以后想再用这个片段的话，直接扩增质粒用质粒上的酶切位点切下即可。
对于一些酶切位点少的片段，也可以在后续的实验中采用质粒上不同的酶切位点切得所要的片段，连接不同的载体。

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