一、ELISA检测人杯状病毒
采用IDEIA™ Norovirus试剂盒（DakoCytomation公司），仅限于检测人杯状病毒中的诺如病毒（属）GⅠ和GⅡ型。
（一）检测前准备工作
1.粪便标本处理：加入1ml样品稀释液（sample diluent）至1.5ml EP管中，加入0.1g固体粪便标本或0.1ml液体粪便标本，置于漩涡震荡器混匀，室温静置10min，室温下≥5000rpm离心5min。
2.阴性对照：将1ml样品稀释液（sample diluent）加至标记好的小瓶中作为阴性对照。
3.阳性对照：1ml对照稀释液（control diluent）溶解阳性对照，使用前混匀。
4.洗液的配制：1倍体积的洗液浓缩液，加9倍体积的去离子H2O。当天用当天配。
（二）标本检测
1. 将需要数量的微孔板置于微孔板架上。
2. 每孔加入100µl 10％便悬液或阴性对照或阳性对照（每次检测均需加一个阳性对照和一个阴性对照），20～30℃静置60±5min。
3. 每孔加入2滴（或100µl）酶结合物（conjugate），用枪头轻柔混匀。
4. 每孔加入350µl洗液，洗5次，在卫生纸上拍干。
5. 每孔加入2滴（或100µl）底物液（Substrate），20～30℃静置30min。待蓝色显现后迅速观察颜色。
6. 每孔加入2滴（或100µl）终止液（Stop solution），充分混匀。
7. 读取OD450值，打印输出或记录OD值。结果必须在加入终止液后30min内读取。
(三) 检测结果的判定：
1. 阴性对照：肉眼观察无色或OD450值<0.15。
2. 临界值：OD450值＝阴性对照OD450值＋0.10。
3. 阳性对照：肉眼观察呈现独特的蓝色或OD450值>0.50。
4. 标本：肉眼观察蓝色比阴性对照颜色深判定为阳性，肉眼观察无色判定为阴性；或者OD450值大于临界值判定为阳性，小于临界值判定为阴性，OD450值在临界值±0.01范围内判定为可疑，应重复检测。
（四）注意事项：
1.打开后的96微孔板应置于可封口的有干燥剂的口袋中贮存于2～8℃，打开后6周内用完。
2.终止液中含0.3mol/L硫酸，避免接触到皮肤和粘膜。如果终止液接触到这些部位立即用水冲洗。
3.未用完的阳性对照可在2～8℃贮存1个月，长期贮存应分装存于-20℃。
4.底物液避光保存，不要使用已经变蓝的底物液。
5.避免污染。
二、人杯状病毒RT-PCR检测
可以同时检测出人杯状病毒中诺如病毒（属）和扎如病毒（属）。
（一）病毒RNA提取：
1．提取前的准备工作：
（1） 将1ml Buffer AVL加入装有低压冻干的Carrier RNA中，彻底溶解Carrier RNA后，将溶有Carrier RNA的Buffer AVL转入至Buffer AVL瓶中，彻底混匀。分装贮存于2～8℃。如果在2～8℃时，Buffer AVL/Carrier RNA溶液形成沉淀，可在80℃重新溶解，注意加热的时间不能超过5min，用前冷却至室温。Buffer AVL/ Carrier RNA溶液不能加热超过6次。
（2） 加入合适比例的96～100％的酒精至Buffer AW1中，19ml的Buffer AW1加入酒精25ml。
（3） 加入合适比例的96～100％的酒精至Buffer AW2中，13ml的Buffer AW2加入酒精30ml。
2．病毒RNA的提取：
（1） 在1.5ml EP管中加入560µl 已加入Carrier RNA的Buffer AVL。
（2） 将140µl 10％便悬液加入至EP管中的Buffer AVL中，vortex混匀15sec。
（3） 室温（15～25℃）孵育10min。
（4） 将1.5ml EP管轻微离心，以去除管内的液滴。
（5） 在管内加入560µl 96～100％的酒精，vortex混匀15sec。混匀后，将1.5ml EP管轻微离心，以去除管内的液滴。
（6） 小心的将630µl步骤5中的溶液加入至已放入至2ml收集管中的QIAamp离心柱中，注意不要弄湿柱子边缘。盖上盖子，8000rmp离心1min。将QIAamp离心柱放置至另一干净的2ml收集管中，弃去包含有滤过液的收集管。
（7） 小心打开QIAamp离心柱的盖子，重复步骤6。
（8） 小心打开QIAamp离心柱的盖子，加入500µl Buffer AW1。盖上盖子，8000rmp离心1min。将QIAamp离心柱放置至另一干净的2ml收集管中，弃去包含有滤过液的收集管。
（9） 小心打开QIAamp离心柱的盖子，加入500µlBuffer AW2。盖上盖子，14,000rmp离心3min。弃去收集管中的滤过液，14,000rmp离心空柱子1min。
（10）将QIAamp离心柱放置入干净的1.5ml离心管中。弃去包含有滤过液的收集管。小心打开QIAamp离心柱的盖子，加入60µl Buffer AVE至离心柱中，盖上盖子，室温孵育1min。8000rmp离心1min。（2×40µl的Buffer AVE洗脱两次，能增加产量。）病毒RNA进行反转录，或贮存于－20℃或－70℃备用。
（二）人杯状病毒ssRNA的反转录：
在0.2mlEP管中配制如下逆转录体系。
引物 | 位置 | 方向 | 核酸序列(5’–3’) |
289H | 4865-4886 | - | TGACGATTTCATCATCACCATC |
289I | 4865-4886 | - | TGACGATTTCATCATCCCCGTC |
290H | 4568-4590 | + | GATTACTCCAGGTGGGACTCCAC |
290I | 4568-4590 | + | GATTACTCCAGGTGGGACTCAAC |
290J | 4568-4590 | + | GATTACTCCAGGTGGGATTCAAC |
290K | 4568-4590 | + | GATTACTCCAGGTGGGATTCCAC |
| 欢迎光临 中国病毒学论坛|我们一直在坚持！ (http://virology.com.cn/) | Powered by Discuz! X3.2 |