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标题: 流感病毒全基因克隆疑惑 [打印本页]

作者: 序道 时间: 2015-8-11 22:33
标题: 流感病毒全基因克隆疑惑
弱弱地问一下：

我们知道，病毒的RNA不能不代表病毒的mRNA，那我们抽提RNA的时候，在反转录（RT）过程中，是否只能Uni 12呢？不能用Oligo dT(18)?基因特异性引物（GSP）可以吗？

上面这些引物哪些是可以将完整的vRNA转录成cDNA的呢？原理是什么呢？

用GSP的话，岂不是只能从5' 端开始设计引物啦？这样的话在3' 端的特异性也很难保证了。

上面是我在这段时间碰到的一些疑惑，也比较纳闷，找了一些资料都没有找到满意的答案，故在这里救助大家，本想在论坛“实验技术”板块也发一贴，但担心有重复提问之嫌，故在本版提出求助，希望能找到比较满意的答案。

原帖链接：http://biosky.haotui.com/thread-7096-1-5.html
楼主：kousyouki

作者: 序道 时间: 2015-8-11 22:33
大部分单股正链RNA病毒的基因组末端含有poly(A)尾,这对病毒基因组RNA的感染性起着非常重要的作用。
（poly(A)尾对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组感染性的影响）
乙脑病毒基因组为单股正链RNA，长约11kb，5′端有帽状结构，3′端无PolyA

有些真核细胞mRNA，如组蛋白mRNA，呼肠弧病毒及一些植物病毒mRNA上没有poly(A)。

有些RNA病毒的mRNA是不带polyA的，一般用随机引物反转录得到cDNA.

Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses
Arch Virol. 2001 Dec;146(12):2275-89.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11811679

Rapid sequencing of the non-coding regions of influenza A virus
Journal of Virological Methods
Volume 139, Issue 1, January 2007, Pages 85-89

1#wwwkkk83

作者: 序道 时间: 2015-8-11 22:34
2#kousyouki
这个我是知道的，对于流感病毒来说是不是这样的呢？？
另外，流感病毒的RT用Uni 12是否能将vRNA完整地反转录为cDNA呢？？

前不久我已经用Oligo dT(18)做RT-PCR了，检测的话可以得到预期目的带，但不知道是否能用Oligo dT(18)做全基因克隆？假如Oligo dT(18)是将流感病毒的mRNA反转录为cDNA的话，就会少了很多个核苷酸了，这样就不算是全基因克隆了吧。因为流感病毒的mRNA并不能代表完整的vRNA啊~~~~~

继续求助o(∩_∩)o...哈哈

作者: 序道 时间: 2015-8-11 22:35
3#photos
首先要明白的是，流感病毒vRNA 5'端13个核苷酸和3'端12个核苷酸是保守的，这是你设计进行RT及设计引物的前提

如果做RT扩病毒的完整cDNA，你必须用Uni12，这样才可把病毒非编码区全部扩出，也就是你说的全基因克隆，如果用Oligo dT(18)的话，会缺失掉部分病毒的非编码区，因而根据你的目的来设计

我还未看到过用Oligo dT(18)做RT引物的，因为我们提取出来的RNA主要是vRNA，用Uni12多好，为何用这个呢？

再有，特异引物肯定可以用，但是这样岂不是很麻烦（8个片段啊！），根据流感5'端和3'端核苷酸即可设计通用引物啊，这个多简单。

作者: 序道 时间: 2015-8-11 22:36
4#kousyouki
photos 兄弟，我确实在检测流感的时候用了Oligo dT(18) 和 Uni 12 进行RT分别做比较了，结果是也可以得到预期目的带。另外，在其他一些病毒检测的时候，我也用了GSP和Oligo dT(18) 分别RT，结果是Oligo dT(18) 的组的预期片段的预期目的带比GSP 组的要亮一些~~~~

还有，我还想问的是：如何才能知道哪些RNA病毒的mRNA是不带polyA的，哪些是带polyA的呢？？

作者: 序道 时间: 2015-8-11 22:38
7#wwwkkk83
有无poly A 参考附件
Characteristics of the genomes of the 30 families of RNA viruses “30个科的RNA病毒基因组结构.pdf ”

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