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标题: 如何选择病毒学研究的细胞？ [打印本页]

作者: wwwkkk83 时间: 2015-10-12 14:30
标题: 如何选择病毒学研究的细胞？
病毒会感染几乎每一种生物机体，无论是人、老鼠、跳蚤还是细菌，都逃脱不了病毒的攻击。但是这些寄生生物无法独立生活：它们需要进入宿主细胞内部，这也就是为什么病毒学家也需要培养细胞，不过要想掌握这种细胞培养技术，就必须对病毒和宿主细胞都有所了解。
因为这个过程并不是简单的把病毒和细胞都放到培养皿中就行，因此要想真正掌握病毒学研究的细胞培养技术，还是需要花费一番功夫的，这里通过了解几位病毒学家的培养思路和技巧，介绍了一些病毒-细胞培养系统和方法。
如何选择细胞
选择哪种细胞取决于病毒，不过要找到正确的病毒宿主可能还要玩一下“侦探游戏”，最明显的首选场所就是作为病毒天然宿主的动物或者组织中的细胞，比如骆驼细胞就是中东呼吸综合征寻找宿主细胞的第一选择。
但想到并不一定就能做到，美国国立卫生研究院国家过敏症和传染病研究院的副主任Marshall Bloom在开始研究阿留申水貂病（Aleutian mink disease）病毒的时候，他曾试过水貂细胞，以及每一种他能买到的哺乳动物细胞系，但唯一能发生感染的是猫肾细胞 (J Virol，73:3835-42，1999 年)。
如果一种病毒被证明十分挑剔，那么就可以多准备一些细胞系，如HeLa细胞系，这种细胞系能作为多种病毒的宿主，Bloom说，此外幼仓鼠肾 (BHK，Baby hamster kidney) 细胞和来自鸡胚胎的成纤维细胞也值得试试，来自佛罗里达大学的名誉教授Richard Condit建议道。
除了细胞类型，病毒学家还必须做出另一个选择，那就是选择直接从生物机体中培养的原代细胞，还是经过多年培养，传代多次的永生细胞系。两者都有利有弊。
永生细胞系，譬如HeLa的优点就是方便，易于生长，可重复性高。来自洛克菲勒大学丙肝研究中心的博士后研究员Mohsan Saeed指出，大多数病毒研究采用的就是这种细胞系。
但是这种细胞大多只能将其相似之处传递给生物机体中的另一细胞，它们不断分裂，改变了它们的新陈代谢，而且也经常发生去分化，重新回归到了原始状态。最关键的是，对于病毒学家来说，这些细胞系只是表现出异常的免疫应答活动，而不是像体内细胞那样对病毒产生防御力，因此从这些细胞系中得到的结果可能就是不确定的，或者错误的。
因此Saeed认为，如果可能的话还是用原代细胞。原代细胞看起来更像体内细胞，反应也更像体内细胞，但是这些细胞会出现并发症，它们需要特殊的培养技巧，而且最终还是会死亡。
如果一个实验室希望用的是人体原代细胞，那么这又要增加一层难度了。一般来说这些细胞内容可以通过商业化产品获得，如Lonza就要卖21种人体原代细胞，包括肝细胞 (300-600万细胞安瓿约为500 美元，注：美国当地价格)。

然而，有时研究人员需要的组织类型并没有哪家公司有卖，或者希望选择特殊的细胞来源，那么他们就不得不去寻找医院细胞来源了。
与克隆系的统一细胞不同，捐赠组织会随着个体差异而发生变化，这可以是益处，也可以是坏处。一些研究人员希望了解病毒如何感染个体病患的，但是一般分子病毒学家还是希望重现性较好，但使用不同批次原代培养细胞，会增加重现性难度。

作者: wwwkkk83 时间: 2015-10-12 14:32
标题: 如何选择病毒——细胞培养的病毒？
病毒会感染几乎每一种生物机体，无论是人、老鼠、跳蚤还是细菌，都逃脱不了病毒的攻击。但是这些寄生生物无法独立生活：它们需要进入宿主细胞内部，这也就是为什么病毒学家也需要培养细胞，不过要想掌握这种细胞培养技术，就必须对病毒和宿主细胞都有所了解。
因为这个过程并不是简单的把病毒和细胞都放到培养皿中就行，因此要想真正掌握病毒学研究的细胞培养技术，还是需要花费一番功夫的，这里通过了解几位病毒学家的培养思路和技巧，介绍了一些病毒-细胞培养系统和方法。

病毒
细胞当然只是培养体系的一半，另一半病毒也存在选择上的问题。一旦病毒开始在培养基中生长，那么它们就会发生改变，为了适应生长速度或毒力而产生突变。Bloom在研究中就发现猫肾培养基中的阿留申病毒会导致水貂患上一种轻微的疾病，至今他们也不清楚原因是什么。
病毒来源的选择主要看个人的目的，如果你希望感染培养基中的每一个单细胞，分析细胞的反应，那么可以选择高感染性的实验室毒株，但是如果要分析潜在治疗的效果，那么建议选择野生型病毒。
在选好细胞系和病毒毒株后，研究人员就要开始考虑所用病毒的剂量，以及感染的时长。
“这并不是最令人感兴趣的实验，但确实实实在在的科研，”Kaushic说。定量病毒感染培养基所需份量，以及计算空斑或蚀斑数量最经典的方法就是在培养皿或培养瓶中的单层细胞实验，每个蚀斑都是单个病毒粒子感染的应答。
研究人员可以利用手头上的数据获得他们想要的感染复数（multiplicity of infection，MOI），即感染实验中病毒-细胞的比率。如果MOI为1，就是每个细胞对应一个病毒，那么只需要感染三分之二的细胞。因为病毒是随机扩散，一些细胞没有碰到病毒感染，而旁边的细胞却有两到三个粒子感染。
为了能均一一对一感染每个细胞，Saeed建议采用MOI为5，如果要分析病毒在细胞间的传播，那么他建议MOI为0.01，这样100个细胞中最开始只有1个被感染，之后再传播到旁边细胞。

此外，研究人员还需监控感染过程，最明显的变化就是致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，大多数的培养细胞能以平铺单层细胞生长，但被感染的细胞也许会出现聚合，或者破裂。“细胞看上去状态并不好，但仍然存活着，并且繁殖病毒，”Fields Virology操作指南作者Condit说。
不过并不是所有的感染都会导致CPE的出现，因此研究人员可能需要采用其它方法，对于培养皿或孔，研究人员可以采用PCR来识别病毒基因，或者Western blotting来检测病毒蛋白。

Kaushic 警告说，找到病毒核酸或蛋白并不一定就确认了病毒的感染和复制能力，比如说，许多HIV研究者会检测核心病毒蛋白p24是否存在，如果一不小心，他们也许识别的就是原初接种的不完整，非活性病毒粒子中的p24。

作者: ghx0123 时间: 2015-10-13 10:02
有深度，好文章

作者: cloudwin 时间: 2015-10-26 12:18
原创吗？加分。

作者: cloudwin 时间: 2015-12-8 12:10
好帖子。。

作者: wwwkkk83 时间: 2016-3-30 10:51
转贴的

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