呼吸道标本中H7N9禽流感病毒全基因组深度测序与分析

hantavirus

【作者】 宋金龙；
【导师】 刘忠民； 林勇平；

【作者基本信息】 [url=]广州医科大学[/url]， 临床检验诊断学， 2014， 硕士
【摘要】 研究背景新发传染病（emerging infectious diseases，EID）是人类面临的一个重要威胁。据WHO的研究报告，自1967年以来，至少有40种新的病原体被发现，其中病毒性病原体超过70%，重要的包括人类免疫缺陷病毒、埃博拉病毒、SARS冠状病毒、禽流感病毒和甲型H1N1病毒等。2013年3月底，在中国华东地区发生人感染H7N9禽流感，截至2014年5月9日，WHO已报道437例经实验室确认的人感染病例，死亡134人，病死率达30.7%，均为散发病例。病例分布于全国大陆13个省/直辖市、香港、台湾地区和马来西亚，其感染仍在不断增加。尽早诊断和尽快接受抗病毒药物治疗是提高治愈率和降低死亡率的关键。新发突发传染病病原体的快速鉴定，在最短时间内准确的获取病原体的全面信息，对于能否有效控制传染病疫情具有决定性的意义。病毒性病原体的检测主要包括病毒抗原检测、核酸检测以及病毒分离培养等。胶体金以免疫层析方法检测H7抗原实现了对H7N9病毒的快速检测，但由于方法学固有的缺陷，会造成对部分感染者的漏检；传统的病毒培养鉴定方法耗时长、要求在生物安全三级实验室进行，H7N9病毒培养难以作为常规项目在医院开展。同时由于病毒在培养的过程中受到选择性的压力会发生一些适应性改变，这些改变可能无法反映病毒在人体致病的真实信息，从而影响到治疗方案的选择。目前，临床实验室主要采用荧光定量PCR技术对疑似H7N9病毒感染的患者进行筛查和确认，其特异性强，敏感度高，但PCR方法必须建立在已知病原体的基因序列基础上，无法实现对未知的突发传染病的病毒病原体进行检测。H7N9是一种低致病性流感病毒，对禽类不致病，人感染后就可能引起严重疾病。疫情防控比高致病性的禽流感H5N1难度更大。迄今为止还没有发现引起人与人之间传播的证据，但也不能排除人与人之间传播的可能。病毒一旦通过基因突变或者重配，获得偏好结合人体呼吸道细胞的能力，就可能会进化为在人际传播的禽流感病毒。有研究表明，H7N9病毒HA基因Q226L突变使与人呼吸道受体结合能力增强，如果PB2基因中同时发生E627K和D701N突变，就可能导致H7N9病毒有效的人传人之间传播。通过检测感染雪貂的呼吸道和其他器官，发现病毒RNA已经侵入了上下呼吸道，淋巴结以及大脑，这一动物模型说明，在适当的条件下，H7N9病毒有可能会在人际之间传播，所以非常需要及时监测H7N9病毒的基因组序列的变化，特别是人感染H7N9毒株的进化、基因变异等，为疫情的评估和防控提供科学依据。高通量测序技术（High Throughput Sequenceing，HTS）也称下一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）能一次并行对几十万和几百万条DNA分子进行序列测定，实现了对一个物种基因组的精细分析。与sanger法的一代测序技术相比，NGS具有通量大、速度快、单碱基成本低等优势。Ion torrent个人化操作基因组测序仪(PGM)是基于新一代的半导体测序技术，使用布满小孔的高密度半导体芯片，每一个小孔就是一个测序反应池，通过检测DNA复制时，反应池中的PH发生改变，从而读出DNA序列，与采用光学原理的其它二代测序仪相比，其操作更简单、测序成本更低、测序时间更短并具有强大的可扩展性，更适合于临床实验室使用。近年来，基于NGS的宏基因组分析方法已成功应用在新病毒检测和发现、病毒准种检测和病毒全基因组测序的等研究工作。本研究通过验证基于NGS技术的宏基因组方法能否在H7N9患者呼吸道标本中直接检测到H7N9病毒序列，为建立突发传染病未知病原体的快速鉴定提供重要的技术方案。通过对标本中的H7N9病毒基因组进行深度测序，分析是否出现对基因变异的病毒准种，为患者的病情评估及临床治疗提供病原学信息。为指导人感染H7N9病毒疫情的防控，对目前公共数据库上63株感染人H7N9病毒重要功能位点的氨基酸变异情况进行统计分析。研究目的1.探索下一代基因测序技术从呼吸道原始标本中直接检测H7N9病毒的基因序列，旨在建立呼吸道突发病毒性传染病病原体快速鉴定的技术方案。2.建立基因特异性扩增结合深度测序方法获得H7N9病毒全基因组序列，分析与病毒耐药和毒力相关位点的重要氨基酸残基变化。3.分析公共数据库中已公布的人感染的H7N9病毒的基因组序列，及时掌握病毒来源、进化、基因变异和致病特征，为疫情的评估及防控提供基础信息。研究方法1.提取PCR阳性的H7N9病毒感染患者的咽拭子标本的病毒核酸，经不依赖序列的单引物扩增技术建库，使用IonTorrent PGM进行宏基因组测序分析，通过生物信息学分析检测病毒病原体。2. PCR特异性扩增H7N9病毒的8个基因片段，使用IonTorrent PGM深度测序并用FluAtyping软件进行流感病毒的组装和分型，获得病毒的全基因组序列（A/Guangdong03-A/H7N9），分析病毒株的进化特征、耐药性位点、致病性及毒力相关位点以及受体结合位点的氨基酸残基变异情况，并与经鸡胚培养后的病毒基因组序列（A/Guangdong03/H7N9）进行比较分析。3.收集目前公共数据库上已有的63株人感染H7N9病毒全基因组序列，应用生物信息学软件DNAMAN8、MEGA5.05等统计分析与病毒耐药、致病性、毒力、受体结合及糖基化相关位点的碱基和氨基酸残基的变异情况。研究结果1.高通量测序获得数据453.31Mb，共2,561,122条读长，其中人的序列2,481,807条（96.9031%），细菌和其他微生物序列79,218条（3.0930%），病毒序列97条（0.0038%），其中有5种病毒包括H7N9病毒序列13条，人类腺病毒7型、猿猴疱疹病毒1型、沙鼠痘病毒序列各1条，西枞色卷蛾颗粒体病毒序列81条。2.成功扩增了H7N9各基因片段，经高通量测序获得数据总量53.86Mb，共有391,805条读长，平均测序深度为1020×。本株病毒发生了HA基因Q226L、T160A，M2基因S31N，PB2基因D701N，PB1基因I368V等重要位点的氨基酸突变，未检测到任何病毒准种。同源性分析表明本株病毒HA基因与A/duck/Fujian/6380/2010(H7N3)， NA基因与A/northern shoveler/HongKong/MPL133/2010(H2N9)的序列相似性最高。经鸡胚培养H7N9病毒的基因组序列与咽拭子标本中直接测序结果比较显示HA基因存在7个碱基差异，其中有义突变3个；NA基因存在一个碱基突变且为有义突变；M基因存在6个碱基突变，其中有义突变2个，NP基因存在53个碱基差异，有义突变6个；NS基因存在33个碱基差异，有义突变9个。3.63株人感染的H7N9病毒HA片段裂解位点氨基酸序列为“PEIPKGR↓G”（↓为裂解位点），有两个碱性氨基酸（K和R）；87.3%（55/63）的毒株HA发生了Q226L变异；96.8%（61/63）的毒株HA片段发生了G186V变异；全部毒株发生了M2片段S31N变异，4.8%（3/63）的毒株NA片段发生了R294K变异；66.1%（41/62）、12.9%（8/62）和6.5%（4/62）的毒株PB2片段分别发生了E627K、D701N和Q591K等已知毒力和传播性增强的突变；88.9%（56/63）的毒株PB1片段发生了已知毒力和传播性增强的I368V变异；所有毒株NA片段发生了69-73位氨基酸缺失。结论1.建立了可用于突发病毒性呼吸道传染病未知病原体快速鉴定的高通量测序技术。2.建立了特异性扩增结合高通量测序直接从呼吸道标本中获得H7N9病毒全基因组序列的技术，可为临床及时提供病毒的耐药和致病性信息。3.63株H7N9病毒都存在金刚烷胺类药物耐药性突变，少数毒株存在神经氨酸酶抑制剂耐药突变，可能是伴随治疗过程出现的。其致病性可能是重要位点突变之间的相互作用形成的。