通过改变RNA病毒聚合酶的保真性来弱化口蹄疫病毒

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口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的，在偶蹄动物中散播性极强的病毒性疾病。口蹄疫病毒是一中变异性很高的病毒，有7个血清型和多个亚型。在宿主细胞细胞质中，口蹄疫病毒RNA依赖RNA聚合酶（RdRp或3Dpol）执行病毒基因组的复制。RdRp是一种低保真性和缺乏校正活性为特征的一种酶，这一特征让FMDV容易发生变异及适应多样的环境。
    近日，美国的科学家使用FMDV的3Dpol 结构结合相似的可纳病毒聚合酶先前的结果，设计能够改变病毒复制保真性的点突变。该研究通过使用生物化学和遗传学的方法，发现用苯丙氨酸（F）替代位于237色氨酸（W），能够使RdRp获得高的保真性；使用异亮氨酸（I）和亮氨酸（L）替代则导致低保真性的表型。该研究还通过一系列试验证实，通过提高或降低RdRp的保真性能够减弱病毒在动物体内的增殖，这一主要特征可用于开发安全及遗传更稳定的疫苗候选株。具体研究工作如下：
     1、FMDV 3Dpol突变位点的选取：科学家通过使用从柯萨奇病毒和脊髓灰质炎病毒3Dpol 保真性突变体研究中获取的FMDV 3Dpol 的结构和信息，选取位于motif A结构的色氨酸237残基进行突变，进而改变FMDV聚合酶的保真性。









    2、FMDV 3Dpol突变株的构建和体外表征：为了研究3Dpol 237残基突变体对FMDV在细胞中增殖的影响，研究人员通过构建W237FHF，W237ILF和W237LLF 突变毒株和野毒株（WT）进行体外对比试验。试验结果发现，在BHK-21细胞中，三种突变毒株的增殖情况与野毒株相比没有明显差异。在猪肾原代细胞中，高保真的W237F突变株呈现增殖减缓的情况。












3、测序鉴定FMDV 3Dpol突变株突变频率：为了评估突变毒株的保真性，研究人员首先将病毒在BHK-21细胞中培养了三代，然后进行突变平率的测定。通过测定FMDV的VP3-VP1高突变区发现，WT毒株每10 kB就有4.48个碱基发生了图片，W237FHF 毒株的突变频率比WT毒株低2.7%，W237ILF和W237LLF 突变毒株的突变频率比WT毒株分别高30%和20%。

4、评估FMDV 3Dpol突变株的适应性：研究人员通过将FMDV突变毒株及WT毒株分别与A24-沉默WT参考毒株共感染细胞BHK-21，来确定突变毒株的相对适应性。结果表明，无论是高保真突变毒株还是低保真突变毒株，其适应性都没有显著改变。

5、FMDV突变毒株毒力的测定：研究人员使用FMDV突变毒株对小鼠进行攻毒试验，发现FMDV高保真突变株和低保真突变株的毒力相对于WT毒株都显著下降。

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文献全文：http://pan.baidu.com/s/1eRKAqrg

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