植物病毒基础

jbclinnic

1. 植物病毒有哪些组分组成? 简述病毒基因组核酸表达一般策略。

    植物病毒的主要成分是核酸和蛋白质，内部是核酸，外部由称为外壳（或衣壳）的蛋白质包被；合称为核蛋白或核衣壳。有的病毒粒体中还含有少量的糖蛋白或脂类。而类病毒则没有蛋白质外壳，仅为RNA的分子。

    病毒转录出+RNA以后，其后的翻译仍然不很顺利。由于真核生物体内的蛋白质合成机构仅仅识别病毒+RNA上的第一个开放阅读框架(open reading frame， ORF)，同一核酸链上其它基因的表达则要借助病毒的特殊翻译策略。现在发现+ssRNA病毒基因组在真核生物蛋白合成系统中有五种翻译策略：

    1．亚基因组RNAs策略 由基因组3’末端转录产生一到多个亚基因组(subgenomic) RNA，从各个亚基因组5’端的开放阅读框架翻译出功能性蛋白，如烟草花叶病毒属。
    2．多聚蛋白策略 基因组核酸具有编码多个蛋白的能力，但是其翻译仅从单一开放阅读框架进行，产生的多聚蛋白(polyproteins)在病毒编码的蛋白酶作用下，分解为多个最终的基因翻译产物，如马铃薯Y病毒属。
    3．多分体基因组策略 病毒的基因组分装在不同的核酸链上，每条核酸链均从5’端进行翻译，直接产生基因的翻译产物，如黄瓜花叶病毒属。
    4．通读蛋白(read—though)策略基因5’开放阅读框架的终止密码子可能漏读  (leaky)，允许一定比例的核糖体继续向下游翻译，直至下一个终止密码子，从而产生第二个更长的功能蛋白，如烟草花叶病毒属复制酶的翻译。
    5．核糖体移码(transframe)策略 在翻译接近开放阅读框架O的终止密码子时，核糖体回读一个核苷酸(少数情况是跳过一个)，这样使终止密码子UAG分到两个三联体密码中，使翻译继续到下一个开放阅读框架，从而产生一个大蛋白。植物病毒的翻译需要寄主核糖体的参与，主要是80S细胞质核糖体，还需要寄主提供氨基酸、tRNA等物质。翻译后有些病毒蛋白还需要再加工才能发挥功能，这一过程也需要寄主酶系统的参与。
                                             
2．以烟草花叶病毒为例，说明病毒基因组结构与生物学功能的关系。

    随着分子生物学研究的进展，越来越多的植物病毒的基因组结构被揭示出来，它们的核酸序列、基因翻译产物的氨基酸序列及其生物学功能，已经有所了解。

    由于植物病毒基因组基因数目少，我们可以画出它们的基因图谱，标出各种基因产物的位置。下面以研究比较清楚、生产上比较重要的烟草花叶病毒(TMV)为例进行介绍。

1．TMV的基因组结构及表达  TMV为+ssRNA病毒，基因组核酸全长6395个核苷酸，共有5个开放阅读框架。核酸的5’端有帽子结构，3’端有类似tRNA的结构。
2．TMV蛋白质的生物学功能  病毒基因组核酸直接作为mRNA翻译的第一个产物就是126kD的复制酶亚基，在ORFl处通读翻译出183kD蛋白，126kD和183kD蛋白组成RNA聚合酶。病毒利用亚基因组核酸的翻译策略，产生三个亚基因组核酸，亚基因组RNA1虽然具有三个开放阅读框架，但只有开放阅读框架3可以翻译，在体外翻译系统中产生54kD的蛋白，这种蛋白目前还没有从病株中分离到。转基因试验证明54kD蛋白可能参与病毒的复制。亚基因组RNA2翻译产生30kD的蛋白，该蛋白为细胞间运动蛋白。免疫金标记试验显示，在病毒通过胞间联丝之前，30kD蛋白已在胞间联丝处存在。对比缺乏运动能力株系(Lsl)的30kD蛋白的氨基酸序列，发现只有一个氨基酸与正常株系不同。互补试验、缺失试验等大量证据表明，30kD蛋白是病毒在细胞间运输所必须的。亚基因组RNA3的翻译产物是17.6kD蛋白，即病毒的衣壳蛋白，它除了结构功能外，还参与症状表现和病毒的长距离运输。
3．以正单链RNA病毒为例，简述植物病毒增殖的过程。
植物病毒作为一种分子寄生物，没有细胞结构，不像真菌那样具有复杂的繁殖器官，也不像细菌那样进行裂殖，而是分别合成核酸和蛋白组分再组装成子代粒体。这种特殊的繁殖方式称为复制增殖(multiplication)。

    从病毒进入寄主细胞到新的子代病毒粒体合成的过程即为一个增殖过程。包括以下主要步骤及特点，下面以+ssRNA病毒的核酸复制为例，介绍病毒复制的一般过程。

    进入活细胞并脱壳：植物病毒以被动方式通过微伤(机械伤或介体造成伤口)直接进入活细胞，并释放核酸，释放核酸的过程也称为脱壳(uncoating)。

    核酸复制和基因表达：核酸复制是传递遗传信息的中心环节，包括产生子代病毒的核酸和产生翻译病毒蛋白质的mRNA。脱壳后的病毒核酸直接作为mRNA，利用寄主提供的核糖体、tRNA、氨基酸等物质和能量，翻译形成病毒专化的 RNA依赖性 RNA聚合酶(RNA—dependent RNA polymerase，RdRp)；在聚合酶作用下，以正链RNA为模板，复制出负链RNA；再以负链RNA为模板，复制出一些亚基因组核酸，同时大量复制出正链RNA；亚基因组核酸翻译出3种蛋白，包括衣壳蛋白。病毒合成的正链RNA与衣壳蛋白进行装配，成为完整的子代病毒粒体。子代病毒粒体可不断增殖并通过胞间联丝进行扩散转移。

4．植物病毒有哪些传染或传播方式?在介体传播中，病毒与介体有何依赖关系?

    病毒是专性寄生物，在自然界生存发展必须在寄主间转移，植物病毒从一植株移或扩散到其它植物的过程称为传播(transmission)，而从植物的一个局部到另一局部的过程称为移动(movement)。因此，传播是病毒住植物群体中的转移，而移动是病毒在个体中的位移。根据自然传播方式的不同，可以分为介体传播和非介体传播两类。介体传播(vector transmission)是指病毒依附在其它生物体上，借它生物体的活动而进行的传播及侵染。包括动物介体和植物介体两类。在病毒传递中没有其它它机体介入的传播方式称非介体传播，包括汁液接触传播、嫁接传播和花粉传播。病毒随种子和无性繁殖材料传带而扩大分布的情况则是—种非介体传播。病毒不同于真菌，在寄主体外的存活期一般比较短，也没有主动侵入寄主无伤组织的能力，因此只有被动的传播，不像真菌那样主动和有效。植物病毒的有效传播，近距离主要靠活体接触摩擦而传播，远距离则依靠寄主繁殖材料和传毒介体的传带。

    介体与所传病毒之间的关系介体与所传病毒之间的关系比较复杂，主要根据病毒是否在虫体内循环、是否增殖以及介体持毒时间长短来划分。病毒经口针、前消化道、后消化道，进入血液循环后到达唾液腺，再经口针传播的过程称为循回，这种病毒与介体的关系称为循回型关系(circulative)，其中的病毒叫做循回型病毒，介体叫做循回型介体。循回型相互关系中又根据病毒是否在介体内增殖而分为增殖型(propagative)和非增殖型(nonpropagative)。病毒不在介体体内循环的相互关系称为非循回型(noncirculative)，根据介体持毒时间的长短可以分为非持久性(nonpersistent)、半持久性(semipersistent)和持久性(persistent)三种相互关系。非循回型的关系全是非持久性的，而循回型关系中又进一步分为半持久性和持久性两种。

5. 植物病毒分类的主要依据是什么?其属、种命名方法与其它病原物有何不同?

    植物病毒分类依据的是病毒最基本、最重要的性质：1.构成病毒基因组的核酸类型(DNA或RNA)；2.核酸是单链(single strand，ss)还是双链(double strand,ds)；3.病毒粒体是否存在脂蛋白包膜；4.病毒形态；5.核酸分段状况(即多分体现象)等。
    植物病毒种的标准名称，仍以寄主英文俗名加上症状来命名。第一个词的首字母要大写，后面的词除专用词汇（如地名等）外首字母一般不大写，如烟草花叶病毒为Tobacco mosaic virus，缩写为TMV；黄瓜花叶病毒为Cucumber mosaic virus，缩写为CMV。属名为专用国际名称，常由典型种的寄主名称(英文或拉丁文)缩写 + 主要特点描述(英文或拉丁文)缩写 + virus拼组而成。如：黄瓜花叶病毒属的学名为Cucu-mo-virus；烟草花叶病毒属为Toba-mo-virus。即植物病毒属的结尾是-virus，科、属名书写时应用斜体，凡是经ICTV批准的确定种(definitive species)的名称均应用斜体书写或打印，而暂定种（tentative species）或属名未定的病毒名称暂用正体。

    类病毒(Viroid)在命名时遵循相似于病毒的规则，因缩写名易与病毒混淆，新命名规则规定类病毒的缩写为Vd，如马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid)缩写为PSTVd。

6. 实验室诊断植物病毒依据哪些原理和方法?

    难于识别的病毒病害需要进行实验室辅助诊断，利用不同病毒间生物学特性的差异，如所致症状类型、传播方式、寄主范围等实验结合文献资料，可对常见、多发病害做出诊断；而对于疑难或新病害则需要结合病毒鉴定进行诊断。实验室诊断常用的方法有鉴别寄主、传染实验、显微镜（光学、电子）观察、血清学检测和核酸杂交等。

7. 类病毒与病毒有哪些异同点?

    类病毒(viroid)的定义是：存在于植物中，分子量为1×105左右的、由246-574个核苷酸组成的单链环状RNA的寄生物。
    类病毒不同于病毒的主要特性

    1．耐热性  要使类病毒失活需要高于100℃的温度。
    2．高度侵染活性  50～100分子的类病毒可以引起成功的侵染，而病毒需要106个粒体以上。
    3．局限的存在部位  类病毒至今仅仅发现于细胞核中，其核酸在体外翻译体系和寄主体内都没有翻译产物的存在，因为其核酸分子上没有翻译起始密码子。
    4．核酸组成的相近性  G／C比相近，55％～58％；有人对比了3种类病毒的核苷酸序列，发现其在很大程度上的同源性，个别核苷酸或者局部片段发生了变化，成为不同的病原，或者不同的株系。研究表明几个甚至一个核苷酸的不同，就会导致致病力的明显变化。
    5．不显性感染  植物带有类病毒但不表现症状的现象极为普遍。经测试36个科的232种植物对马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的感病性，发现有11个科的138种植物是感染的，但只有茄科和菊科的12种植物表现症状，即90％以上的寄主都是不显症感染，而且潜育期很长，有的几个月，有的甚至几年。
    6．传播方式简单  类病毒主要通过农具、嫁接刀具等传播，大部分可以通过种子传播(有的可在种子中存活20年)；仅仅有危害马铃薯和番茄的二种类病毒被证明有节肢动物介体传播。

8．如何进行植物病毒病的诊断和鉴定?

    植物病毒病的识别、诊断及病原鉴定往往比真菌和细菌病害复杂得多。因为非侵染性病害、遗传生理病害、药害以及植原体引起的病害都与病毒病症状相似。植物病毒病的诊断包括两个方面，一是对病植物标样作初步检查与判断，确定植物发生的病害是否是病毒病；二是对确信是病毒病的样本作进一步的实验诊断，必要时还需作进一步的病原鉴定。因此，植物病毒病的诊断通常要依据症状、发生条件、寄主范围、植物生境，光学与电子显微镜观察、传染方式、血清学反应和分子生物学鉴定等。

    首先要区分非侵染性病害与侵染性病害。要点是（1）病毒病有发病中心或中心病株，早期病株点片分布，而非侵染性病害大多同时大面积发生；（2）发生病毒病的植株多为系统感染，症状分布不均一，新叶新梢上症状最明显，而生理性病害大多比较均一；（3）病毒病有传染性，非传染性病害没有传染扩散的过程；（4）病毒病害症状往往表现为花叶、黄化、矮缩、丛生等，少数有脉带、环斑、耳突、斑驳、蚀纹等特征性症状。此外，随着气温的变化，特别是在高温条件下，植物病毒病时常发生隐症现象。

    病毒病与其它病原生物引起的侵染性病害的主要区别是（1）病毒病害在植物表面绝对没有病征，而区别于线虫虫体、细菌菌脓、真菌的子实体等病症的出现；（2）系统侵染病毒病的症状在新展幼叶上更重，而其他病害则大多在老叶上症状更明显。
难于识别的病毒病害需要进行实验室辅助诊断，利用不同病毒间生物学特性的差异，如所致症状类型、传播方式、寄主范围等实验结合文献资料，可对常见、多发病害做出诊断；而对于疑难或新病害则需要结合病毒鉴定进行诊断。实验室诊断常用的方法有鉴别寄主、传染实验、显微镜（光学、电子）观察、血清学检测和核酸杂交等。