[转移贴]-流感病毒空斑试验问题 很着急 求助 谢谢

rojjer

原帖由pothology 发表于 8/6/2012 14:29
做空斑实验时每次铺完琼脂后细胞都坚持不了24小时就变圆了间隙都变宽了估计都死了，对照组也是这样，不知道是怎么回事。用的是Lonza SeaPlaque Agarose低熔点琼脂，终浓度在0.6%-0.7%左右，请大家说说是什么原因，实在是做不出来。谢谢了……关于tpck-trypsin和BSA浓度选择，我是用不加琼脂不加病毒的培养确定的最小浓度的。

rojjer

osakaleon：
think about the medium   something wrong with the medium

极乐净土：
做流感空斑，不要在摸索其他条件了。
低熔点琼脂终浓度0.5%，0.3%BSA，0.5ug/ml TPCK-trpsin。
用预冷opti-MEM 10倍连续稀释病毒，37度感作1h，后吸出病毒液，加入混好的培养液
熔点琼脂和2xMEM培养液混合好后，放在37度水浴锅。感作结束后，直接把混合，加到细胞板里。室温放置10min，然后倒置在37度培养箱2-3天即可见到空斑。
有多碱性氨基酸的病毒（如H5)可以不加TPCK-Trpsin，加了也没有坏处，没有多碱性裂解位点的病毒（H3，H1，H2等），一定要加TPCK-Trpsin。如果在不清楚的情况下，可以添加TPCK-Trpsin。
楼主的问题可能是：1.细胞烫死 2。培养液不对
要是再做不出来，神也没有办法了。这是我们实验室几十年的配方。

pothology：
非常感谢回复 也不知道哪里做错了  培养基是1个月前配的  低熔点琼脂  都是低于37摄氏度 铺的板子   细胞像是消化下来了 都变圆了  非常感谢

pothology：
有可能是2*DMEM出问题了？时间长了的过吗？  要不用1*DMEM试试可以吗？

osakaleon：
5# pothology

zzx219：
试着用用MDCK-ultra-medium. serum free.


missann111：
3# 极乐净土
不知道还有没有做过其他病毒，希望也可以分享一下经验
1# pothology

我也在做空斑，虽然不是流感病毒，但遇到的问题和你的差不多，每次细胞样子都很差。
但是我也做了甲基纤维素，空斑还是蛮好的，所以我感觉不是培养基的问题，可能是琼脂糖的问题。
琼脂糖我试了三种，效果都不好，有biowest,sea plaque,sea kem是最近又换到，但还是不怎么好。

pothology：
这个琼脂糖介绍中说可以用于细胞试验。以前有的实验室用最普通的琼脂都能做出了。

missann111：
是啊，我记得我以前用的普通的biowest,加中性红，也做出来了。
不知道现在怎么回事，做不出来，


pothology：
11# missann111
sigma 的tpck-trypsin也有好多种。我选的是t1426 文献有报道。会不会有问题。实在不行就用普通胰酶和普通琼脂。难道是低熔点琼脂对细胞有损害。

2# osakaleon
和琼脂糖关系大吗？这个低熔点琼脂有问题？

路漫漫而修远：
[请教甲基纤维素多少浓度？能不能提供详细的步骤啊 谢谢了  

No you can not use 1XMEM,