双链 DNA 酶预处理可降低分子诊断真菌感染中试剂污染

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核酸扩增技术有别于传统的真菌诊断方法，即便是极微量的真菌 DNA，也能够检测出。它具有灵敏度高，能够快速筛查出怀疑侵袭性真菌感染患者的优点。

然而，PCR 扩增技术的致命缺点也源于它的高敏感性，有时极低水平的污染也有可能导致假阳性结果。尤其是某些宽泛的检查真菌感染方法，例如基于 16S rRNA 基因检测时，如果 PCR 试剂如 Taq DNA 聚合酶或是尿嘧啶 -N- 糖基化酶（UNG 酶）被真菌污染，那么检测效果将大打折扣。

有文献报道称，空气中的分生孢子、PCR 扩增所用的引物、探针、酶以及 DNA 提取试剂盒中微量的真菌 DNA 是污染的主要来源。

为了解决这个问题，来自奥地利儿童癌症研究所的 Lion 团队建立了一种基于双链特异性 DNA 酶去除真菌污染的方法。由于酶的双链特异性，单链 DNA 分子如引物、Taqman 探针都不会被酶所消化，除非它们自身形成了发夹结构或引物二聚体。该研究结果发表在近期的 Journal of clinical microbiology 杂志上。

1. 在进行正式的诊断性实验前，先用双链 DNA 酶预处理 PCR 反应中的各种试剂。

2. 每一种探针和引物配制成一定浓度的溶液后，先在 40℃ 预热 5 分钟，以便去除探针自身形成的发夹结构或引物二聚体。

3. 然后 40℃ 30 分钟，进行酶消化反应，之后再 65℃ 15 分钟灭活 DNA 酶。

4. Master Mix 溶液酶消化的反应条件稍有不同，先 37℃ 20 分钟进行消化，之后 60℃ 20 分钟将酶灭活。

研究人员发现，不论是引物、探针还是 Master Mix 溶液，均存在一定程度的真菌 DNA 污染，经酶处理过的试剂，诊断性实验中 PCR 反应的 Ct 值明显高于未处理组，DNA 产物浓度低于未处理组数百倍。通过使用这种双链特异性的 DNA 酶，大大降低了由试剂污染带来的假阳性结果的机率。

鉴于目前还没有商品化的真菌级别的试剂盒，研究人员强烈建议用这种方法常规监测 PCR 检测试剂是否存在真菌污染，预处理试剂消除可能存在的真菌 DNA, 对减少因试剂污染导致的真菌感染假阳性结果至关重要。

如果有商品化的试剂盒存在，可以将 DNA 酶直接加入到 PCR 反应中，缩短检测时间，那将是皆大欢喜的结果。一方面，简化了操作流程，减少了检测人员的操作步骤，可以更快出结果。另一方面也减少了患者和医生的等待时间。

来源：丁香园作者：汐芮