深度测序技术在病毒学中的应用

hantavirus

1、深度测序技术简介

         近些年来，高通量测序技术迅猛发展，由传统的 sanger 一代测序仪、高通量的二代测序仪（next gene- ration sequencing, NGS），发展到现在各大公司争相研制的三代测序仪。目前，二代测序（Next Generation Sequencing）技术发展十分迅猛，应用领域不断扩展。

        

       罗氏公司可谓新一代测序技术的奠基人，454 基因组测序仪是最早出现的第二代高通量测序仪。该仪器最初以其准确性高、可读序列长、测序时间短等特点曾经活跃于该领域。很多研究者也因其昂贵的测序费用及较低的通量而寻求其他的测序平台。2011 年Life Technologies 公司推出的新款快速高通量测序仪 Ion Torrent 是目前最快的高通量测序仪，该仪器可以实现 1千万条以上 DNA序列的并行测定，每条序列的长度可以达到400bp，并且从样品制备到测序完成仅需要十几个小时。

      三代测序拥有更先进的技术、更高的通量、更长的读长、更少的模板量和更快的速度，目前市场上已投入使用的三代测序仪仅有 Pacific Biosciences  公司研发的 PACBIO RS 单分子实时测序系统，革命性地推出了单分子实时(Single  Molecule  Real  Time, SMRT)DNA 测序技术。各大测序平台竞相推出通量更大、功能更强的仪器，高通量测序技术越来越被广大研究者接受和使用。

深度测序技术在病毒学中的应用。      

        而病毒，尤其是RNA病毒，基因很容易变异，由此，所谓的病毒其实是很多不同基因组的混合体，即所谓的准种概念，准种现象普遍存在于RNA 病毒中。病毒的变异与准种变迁密切相关，变异的多样性是准种产生的根本原因。准种的变迁影响着患者的临床表现及对抗病毒药物的治疗反应，特别是准种的构成与抗病毒药物的耐药性之间存在着密切的联系。研究准种有助于从整体、动态的角度认识病毒，有利于更加合理有效地预防、诊断和治疗病毒感染。新一代高通量测序技术的出现为准种的研究开辟了一条新途径。常规方法对于多个病原微生物混合感染的判断会产生一定偏差，而对于未见报道的病原微生物则很难检测。使用新一代测序平台，对病原微生物群体的检测不再需要逐一进行病原分离，而是提取DNA 或RNA 后进行测序，通过得到的大量序列信息，从整体上把握病原微生物群体的组成情况，也可获得丰度低的病原序列，还可鉴定新的物种。特别是如果预先定义每种病原微生物的特征序列谱，在测序结果中逐一比对，可以迅速识别各类病原微生物，使诊断时间缩短，诊断结果更加精确。     
        
        由此。深度测序技术，对于病毒的研究具有较强的应用价值和意义。根据文献报道，下面简单罗列几个深度测序技术在病毒学中的应用。



2、深度测序技术在病毒学中应用

2.1流感病毒
    为了研究感染甲型流感病毒的病人体内潜在的病原体及其相互作用，Kuroda M 等将感染甲型H1N1病毒性肺炎死亡病人肺脏的总RNA 提取出来，合成cDNA，使用Illumina Genome Analyzer Ⅱ ( GA Ⅱ) 进行从头测序，对病人的潜在病原体和病毒的准种异质性进行了全面分析。结果发现，98% 以上的序列都是人类基因组序列，甲型H1N1 病毒和细菌的序列分别占0． 850% 和0． 005%，不仅如此，研究还发现H1N1 病毒血凝素抗原Sa 和Ca 两位点存在2 种氨基酸准种现象，同时用荧光定量PCR 技术进行验证，发现了一种在组织学上从未观察到的重要的细菌感
染，推测除了A 型流感病毒，所有潜在的病原( 如肺炎链球菌等) 都可能使甲型流感病毒感染的病死率提高，造成更严重的后果。这些发现使得高通量测序技术作为一种既快捷、又节约成本的新技术得以广泛地应用在病原体的检测上。

2.1 未知病毒检测的应用：如轮状病毒疫苗中PCV外源因子的检出
   轮状病毒是全球引起婴幼儿急性胃肠炎的最主要病原体，目前尚无有效的治疗药物，而疫苗是预防轮状病毒感染最经济有效的手段。在疫苗的质量控制中，外源因子是重要的检测指标。在2010 年，葛兰素史克和默克世界两大疫苗生产厂商所生产的Rotarix和RotaTeq中，均检出有外源因子———猪圆环病毒。该外源因子的检出究得益于深度测序技术的应用。这是继肠套叠事件之后，轮状病毒疫苗的安全性问题再度成为卫生领域关注的焦点。
   2011 年6月24 日，Vaccine 杂志发表了FDA 实验室的实验结果,研究证明，GSK 公司的Rotarix 中存在PCV1 的全长DNA 序列，且以类病毒
颗粒的形式存在；用猪睾丸细胞（ST）和无PCV1 的传代猪肾细胞（PK-15）进行病毒培养，证实Rotarix中的PCV1 DNA 序列可重新产生感染性病毒粒子。RotaTeq 中的PCV1 和PCV2 的DNA 量少且呈片段状，无PCV 全基因组；用细胞培养的方法也不能扩增出感染性病毒。

2.3 在植物病毒中的应用   
     目前利用 NGS 测定 siRNA 已在一系列植物的未知病原鉴定中发挥了重要作用. 一个典型的案例来自 Li 等人对美国和墨西哥分离的表现斑驳、花叶、矮化、叶畸形等症状的 4 个番茄样品的小RNA 进行 NGS. 他们通过消减寄主来源的 siRNA 对vsiRNA 进行富集和组装, 进一步的生物信息学分析显示, 形成的 contigs 能拼接出一个完整的马铃薯纺锤形块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid, PSTVd)的基因组序列, 并证实 2 个核苷酸同源性为 82%的PepMV 株系(Eu 和 US1)在美国样品中普遍存在复合侵染现象. 进一步通过在 NCBI 数据库进行的BLASTx 比对, 发现来自墨西哥样品的 2 个最长的contigs 与几个已知的马铃薯病毒科病毒的氨基酸序列同源性在 60%左右, 利用这 2个 contigs有 13 nt重复的特点, 通过重叠RT-PCR和RACE扩增的方法获得了一个长 10057 nt 的新的马铃薯病毒科病毒。

    还有，很多应用在此不一一举例了，个人感觉深度测序技术在病毒学研究具有很强的促进作用，尤其是对于病毒机理研究，新发未知病毒的检测，疫苗生产中毒种库的质量控制等等。

主要参考文献：

安小平. 利用高通量测序筛查未知病毒的相关技术研究[D]. 中国人民解放军军事医学科学院, 2014.

于晴川, 国泰, 王军志. 轮状病毒疫苗中猪圆环病毒的污染情况[J]. 中国生物制品学杂志, 2012, 12: 043.

钱亚娟, 徐毅, 周琦, 等. 利用深度测序技术发掘植物病毒资源[J]. 中国科学: 生命科学, 2014, 4: 004.

宋金龙. 呼吸道标本中 H7N9 禽流感病毒全基因组深度测序与分析[D]. 广州医科大学, 2014.

王铭杰, 龚玲, 张欣欣. 超深度测序技术在 HBV 准种研究中的应用进展[J]. 中华肝脏病杂志, 2014, 22(005): 389-392.

marine0425030

支持原创，是不是考虑写成文章投到JAV上啊。。。

序道

请问一下，基于病毒或细菌宏基因组学测序分析与深度测序技术有什么联系吗？谢谢

序道

请问一下，基于病毒或细菌宏基因组学测序分析与深度测序技术有什么联系吗？谢谢