昆虫病原细菌、真菌的分离及病毒的提纯

樽满秋华

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一、目的要求：
昆虫病原体的采集，整理是研究昆虫病理和利用微生物进行害虫防治的第一步。识别症状是诊断学的主要内容。本实验要求对昆虫疾病有一个较直观的了解，从而为今后工作打下基础。

二、实验内容：
1． 病体材料的收集
因病死亡的昆虫，可发现于植物的枝叶、茎内、花苞。果实中地表土下等，样本多数脆弱。因此，采集时应以单个样本连同基物的一部份或全部置于小瓶中，并加棉塞。
已收集到的病、死虫体，应迅速处理，进行检查，鉴定和分离病原，并没有进行寄主病情的描述，进行编号和记载，也要考虑到病理组织学的研究和回接试验所用。因此，要有一定的标本数量。同时，有必要对采到的材料进行暂时保存。冷藏可进一步阻止样本进一步腐解，可将病虫死体置于冰箱保存。
2． 样本的症状识别：
⑴ 细菌病的一般特征：感病昆虫活动力减退，食欲减退，食量大减，口腔、肛门常有吐泻排泻物，多数因败血症而死亡。死虫躺卧在植物或其他物质表面，或侧挂于枝叶。体色多加深至黑色或红色。内部组织崩溃粘液态，有时发臭。
⑵真菌病的一般特征：死虫笔直僵硬，体表多覆盖有菌丝或孢子，呈现白色、黄色、红色、褐色或绿色、黑色等。体脆，受压易碎裂。
⑶病毒病的一般特征：类似于细菌，但无上吐下泻现象。死虫常倒挂或平卧于植物上。虫体柔软，表皮一触即破。内部组织液化。
3． 观察下列标本：
⑴ 细菌病：菜青虫、小菜蛾、柑桔凤蝶。
⑵真菌病：虫霉：桃蚜、蝉、蝇。
冬虫夏草
白僵：松毛、象虫、稻纵卷时螟、瓢虫
绿僵：菜青虫
菜氏蛾霉：柑桔粉虱
轮枝：蚜虫
青霉：荔枝
拟青霉：柑桔卷叶蛾
⑶病毒病：NPV：8305、棉铃虫、松毛虫。舞毒蛾
GV：菜青虫、小菜蛾、东方粉蛾
⑷线虫：DD—136

三、目的要求：
为了获得昆虫病原微生物，为鉴定、分类等到的研究和生产应用，首先就必需对罹病昆虫进行分离筛选，对它们的杀虫能力和其他特性进行比较鉴定。最后选出毒力高、性能优良的品系供防治害虫用。
四、实验材料：
解剖皿 75%酒精
剪刀 0-1%升汞
镊子 无菌水
接种环 磷酸缓冲液（PBS）
培养皿
天平
离心机
滤纸
五、实验内容：
1.病原细菌的分离：把罹病昆虫放入75%酒精中浸泡0.5分钟然后放在0.1%升汞中消毒0.5～1分钟，再以灭菌洗3次。表面消毒后放入解剖皿，解剖皿的表面石蜡须以75％酒精洗擦消毒，并掠过火焰。虫体从背面或腹面进行纵向解剖。所有器械事先均须消毒。注意不能使肠壁破裂。血液可体液取出，用无菌水稀释，每培养皿装入2ml左右无菌水，共用3个培养皿，从第1皿中用接种环移入３环至第２皿，再从第２皿移入3环至第3皿，最后倒入冷却至40-50。C的细菌培养基，放入30。C温箱培养。一天后进行菌落观察，并用划线阖进行纯化。纯化后的细菌转入斜面培养并置于冰箱保存。
2.病原真菌的分离：被真菌侵染的虫体，可以用灭菌的镊子，或接种针，直接从体表挑取菌丝或孢子而移接于适宜的真菌培养革上培养。应同时进行体表和内部真菌的分离，检验是否为同一菌种。在25。C左右培养。由于真菌一般比细菌生长慢，有时为了控制细菌污染，可在培养基中加入少量的抗菌素。
3.昆虫病毒的提纯：病毒、立克次氏体，原生动物和多数线虫不像真菌和细菌那样奶在人工培养基上培养。针对昆虫病毒，主要是进行提纯，以供鉴定，分类等研究之用。
⑴低速差异离心法：将病虫称重后捣碎，以1:40比例，即1克虫体加40ml磷酸缓冲液（PBS），过滤去渣，滤液以500转/分离心15分钟，除去组织碎片杂质（沉渣），上清液再以4000转/分离心2小时，弃去上清液，取沉淀。如此可反复几次。用滤纸吸干再冰冻干燥。
⑵ 丙酮一乳糖共沉法：怪病虫称重后捣碎，以1:40PBS稀释，尼龙纱过滤，滤液经1500~2000转/分离心2小时，弃上清液，按1:10加5%乳糖溶液，充分搅拌后，缓缓加入4倍量丙酮，边加边搅拌30分钟，静置10分钟，3500转/分离心20分钟。将沉淀物缓缓加入适量丙酮，边加边搅拌30分钟，再离心，如此重复3次即可得到灰白色粉状病毒，经冷却干燥，称重，于冰箱中保存。
此外，还有蔗糖梯度分离法和分子筛胶层析法。