免疫血清的制备

cao1976

免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂(如用于制备免疫标记抗体等)，也可供特异性免疫治疗用。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。

　　一、原理

　　具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物(即多克隆抗体)。另外，抗体的产生具有回忆应答的规律性，牨m现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。

　　二、免疫方法

　　根据抗原的性质不同而异。下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。

　　1.　用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；

　　2.　第一次免疫： 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

　　3.　第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧 窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧　窝及鼠蹊部皮下。

　　4.　间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。

　　5.　若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。

　　三、放血

　　(一)　心脏采用血法

　　1.　家兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；

　　2.　剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；

　　3.　用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位；

　　4.　用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死；

　　5.　将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。

　　(二)　颈动脉放血法

　　1.　家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤；

　　2.　沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌；

　　3.　分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离；

　　4.　于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住；

　　5.　用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；

　　6.　松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。

　　四、分离血清

　　将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。

　　五、结果鉴定

　　以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关部分。

　　六、材料

　　(一)　动物：健康成年家兔，雄性，体重2～3公斤。

　　(二)　器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。

　　(三)　试剂

　　1.　灭菌生理盐水；

　　2.　纯化人IgG(10mg／ml)；

　　3.　消毒酒精及碘酒；

　　4.　羊毛脂；

　　5.　石蜡油；

　　6.　活卡价苗(BCG)(75mg／ml)；

　　7.　弗氏不完全佐剂(FIA)制备：称羊毛脂10克，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中(每瓶10ml)，高压灭菌(8磅20分钟)后保存备用。

　　8.　弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：将FIA予温(60℃30分钟)，吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG(75mg／ml)0.5ml及纯化人IgG2.5ml(2.4mg／ml)牨_滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

　　七、注意事项

　　1.　免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。

　　2.　免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡(频率2900转／分，振幅6mm)；后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。

　　3.　佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物(0.005mgN)产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠其次是家兔，当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。

　　4.　抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下，一次注入的总剂量以0.5mg／kg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10倍。另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少次注射。

　　5.　免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，同时于两侧肩部(或臂部)和鼠蹊部各注一处。每点注0.2ml，间隔2周后再于上述部位选不同点同上注射，也可产生高效价的免疫血清。