【转移贴】微载体培养技术

cao1976

原贴由A-JUN 发表于 2007-11-26 16:36
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影响生物反应器哺乳动物细胞高密度培养的因素

进年来随着生物技术的发展，越来越多的生物制品进入工业化生产阶段，包括单克隆抗体、重组生物活性蛋白及疫苗等。虽然利用原核表达系统大规模生产重组蛋白具有许多优点，但是由于缺乏有效的糖基化修饰，其利用受到限制。因此，利用哺乳动物细胞生产生物制品成为目前研究的重点。
与传统的微生物培养相比，哺乳动物细胞培养更加困难。主要原因在于：1.哺乳动物细胞生长繁殖的贴壁依赖性和接触抑制作用限制了细胞的生长。2.哺乳动物细胞对培养环境要求较高，对剪切力敏感，容易受到损伤死亡。3.培养工艺放大困难。
    影响哺乳动物细胞培养的因素很多，而且它们之间还相互影响。只有综合考虑各种培养条件，优化培养工艺，才能提高细胞培养密度。
    影响细胞培养的因素可分为三大类：
1.细胞利用的贴壁面积。
2.培养环境中的物理因素。
3.细胞利用的营养物质和代谢产物。

一.细胞贴壁面积对细胞培养的影响
    由于细胞培养的单层生长现象，培养系统中的细胞数量并不依赖于培养的体积，而是与培养系统提供的细胞贴壁面积有关。传统的转瓶培养，很难提高细胞的贴壁面积，因此大规模生产的效率很低。
    1976年，Van Wezel（1）首次报道使用微载体培养动物细胞，创立了生物反应器微载体培养细胞工艺，使动物细胞培养进入高密度培养阶段。微载体培养细胞技术经过几十年的发展完善，目前已实现工业化生产。国外使用微载体体细胞生产β-IFN达到1000L规模。（2）法国的巴斯德研究所使用生物反应器生产脊髓灰质炎疫苗和狂犬病疫苗，规模也已达到1000L。（3）
    微载体按制造材料可以分为六大类：中空玻璃微载体、葡聚糖微载体、聚苯乙烯微载体、交联明胶微载体、聚苯烯酰胺微载体和纤维素微载体。微载体按结构可分为两大类：实心球微载体和中空多孔微载体。中空多孔微载体因为具有更大的面积/体积比，因此具有更好的应用前景。
    目前常用的微载体是葡聚糖类的Cytodex系列微载体，Cytodex1及Cytodex2 带有正电荷，常用于培养Vero细胞、CHO细胞以及其它传代细胞。Cytodex3 不带电荷且表面包被有胶原，通常用于肝细胞。
    单位体积中的微载体越多，细胞能利用的贴壁面积就越大。但是过大的微载体密度，由于所带电荷密度的增加，会产生细胞毒性作用，影响细胞的生长。Hu报道微载体在2-10g/L范围内，FS-4细胞的生长速度随微载体密度增加而降低。（4）
二.物理因素对细胞培养的影响
    在细胞培养中的许多作用力（如搅拌和气泡产生的剪切力）作用下，贴在微载体上生长的细胞会受到损伤，抑制细胞生长，并导致细胞死亡。这些作用力主要包括：
1.液体和微载体的相互作用力。
2.微载体与微载体的相互作用力。
3.微载体与气泡的相互作用力。
1.液体与微载体的相互作用
    机械搅拌情况下，系统的雷诺系数Re>1000时，体统会出现湍流现象，产生湍流涡旋。在搅拌桨区域产生的涡旋最大，其尺寸与搅拌桨的直径相当，并由它衍生出一系列较小的涡旋。其中最小涡旋的尺寸称之为Kalmogorov边际尺寸，培养过程中细胞损伤与Kalmogorov边际尺寸有关。当湍流涡旋大于微载体直径时，微载体进入涡旋内部并随之运动；当湍流涡旋小于微载体时，涡旋把能量传递给微载体，加速微载体的运动；当湍流涡旋与微载体相当时，涡旋与微载体相互作用，产生剪切力，损伤微载体上的细胞。当转速提高一倍时，Kalmogorov边际尺寸几乎减少一半，从而使剪切力增大一倍。Cherry报道培养牛胚胎肾细胞（BEK）时，当涡旋大小/微载体比值在1.0-0.6范围内时，细胞生长速率随涡旋大小/微载体比值减小而呈线性降低，尤其当其降低到0.5以下时细胞几乎停止生长。（5）（6）但是同时有其它试验表明，在微载体系统中，涡旋引起的剪切力对细胞的直接损伤并不严重，其对细胞是主要影响在于使细胞从微载体表面大量脱落。（7）
降低转速可以降低涡旋剪切力。在灌流培养后期，由于细胞在微载体上的大量生长，微载体粘联成团，密度增大，必须增大搅拌速度才能使微载体充分分散悬浮；另外，为了获得较好的氧传递效果，也必须增大搅拌速度。因此，在细胞高密度培养，尤其是灌流悬浮培养后期，如何有效的控制涡旋剪切力，这是目前的一个难题。
2.微载体与微载体的相互作用
    微载体与微载体之间的相互碰撞，是高速搅拌系统中细胞损伤的重要因素之一。微载体碰撞对细胞损伤程度与微载体的密度、运动速度和微载体碰撞频率有关。增大转速和微载体的密度都会增加微载体对细胞的损伤。
   降低微载体碰撞及涡旋剪切力对细胞损伤的最有效的方法是采用微载体固定填充床式生物反应器，其中液体保持层流状态，微载体静止不动，因此能有效降低细胞的物理损伤。但是由于填充床式生物反应器各处存在代谢产物和溶解氧浓度差异，同样会限制细胞的生长，同时由于其细胞传代困难，难以实现生物反应器的扩大培养。
3.微载体与气泡的相互作用
为了获得较好的氧传递效果，满足细胞生长需求，一般采用培养基深层通气方式供氧，但是上升的气泡会损伤细胞。Tramper发现悬浮细胞能被上升的气泡吸附带到液面，随后陷入气泡并被杀死。降低气液表面张力可以防止气泡吸附细胞。（8）这正是血清蛋白、表面活性剂Pluronic F38和聚乙二醇对悬浮细胞具有保护功能的原理。但是以后的研究表明，Pluronic F68等对微载体培养的细胞没有保护作用，而且Bacter报道使用微载体培养CHO细胞，虽然细胞陷入泡沫中，但是细胞并不死亡。（9）因此气泡对微载体上的细胞损伤与对悬浮培养细胞损伤机制并不完全相同。有的学者认为，气泡对微载体上细胞的吸附作用只是使细胞脱落。微载体系统中气泡对细胞的损伤作用，主要在于气泡破裂产生的巨大剪切力，这是微载体系统中细胞物理损伤的主要原因之一。
    减小气泡对细胞损伤作用的根本方法是细胞培养区域和气体交换区域的隔离，使气泡不能与细胞接触，但这样往往会影响氧传递效果。
三.细胞代谢对细胞生长的影响
    哺乳动物的细胞培养基一般以葡萄糖为碳源，氨基酸为氮源，并添加维生素等细胞生长必须成分。细胞代谢葡萄糖产生乳酸或丙酮酸和二氧化碳，代谢谷氨酰胺产生丙氨酸和氨。（10）
    氧是动物细胞生长的必要物质，在培养过程中，细胞大量消耗氧，导致溶氧急剧降低。氧的缺乏将降低细胞的生长速度，当溶氧小于2%空气饱和度时细胞将停止生长，但是当溶氧大于98%空气饱和度时会产生细胞毒性作用。（11）（12）Balin 报道细胞正常生长对溶氧的需求下限为6%空气饱和度。（13）成纤维细胞和上皮细胞对溶氧的需求并不一样，成纤维细胞对溶氧的需求较小。原代小鼠心室细胞生长最适氧分压为27%空气饱和度，而猴肾细胞NCTC8939细胞生长的最适氧分压至少为50%空气饱和度。（12）因此，培养系统氧分压应保持在20-80%空气饱和度范围内。
    CO2在系统中的积累导致PH下降，能降低细胞代谢的酶活力，影响细胞生长。生理条件下CO2的分压为50-70mmHg。Kimuroa报道当PCO2从36mmHg（渗透压为310mOsm/kg）升高到250mmHg（渗透压为376mOsm/kg）时，CHO细胞生长速度降低30%。（14）
    NH3的积累对细胞有很大的毒害作用，细胞对NH3的浓度十分敏感，Visex报道NH3浓度大于2mM时会产生细胞毒性作用。（15）高浓度的NH3会影响糖和谷氨酰胺代谢，降低糖的消耗，促进丙氨酸的积累。（16）因此灌流系统中，NH3浓度最好保持在2mM以下。
    乳酸虽然对细胞没有直接的毒性，但是乳酸的产生会降低PH，并降低糖的利用率，而且有文献报道，高浓度的乳酸能影响病毒的繁殖。
    控制培养系统中营养物质及代谢产物的方法是采用灌流培养工艺，通过不断的补充新鲜培养基，排出代谢产物，控制有害代谢产物的积累。灌流培养方式始于20世纪60年代，1983年Butler对灌流培养MDCK细胞作了系统研究，NH3浓度得到了很好的控制，第六天NH3浓度为2.3mM，相应得到的最大细胞密度为107cells/ml，成为当时最好的细胞培养密度记录。（17）Nahapetian 比较了Vero细胞的分批培养和灌流培养，分批培养的乳酸浓度是灌流培养的2.5倍，NH3浓度是灌流培养的3倍，而细胞密度只有灌流培养的十分之一。（11）但是灌流培养液存在培养液使用量大等缺点，因此需要寻找其它控制有害产物积累的方法。
    大量试验证明，细胞消耗葡萄糖并不是获得能量的主要代谢方式，而是为细胞合成代谢提供前体物质，细胞所需能量主要来自于谷氨酰胺的分解。（18）
    1965年，Graff报道当葡萄糖浓度很高时，细胞消耗的葡萄糖要比其所需要的多，此时便产生大量的乳酸；而当葡萄糖浓度降低到0.056mM时，细胞代谢葡萄糖几乎不产生乳酸。1978年，Zielke报道0.08mM的葡萄糖度细胞生长是必须的。1996年，Poertner报道杂交瘤细胞葡萄糖需求下限为1mM。（19）Sanfelin 指出细胞代谢葡萄糖产生乳酸过程并不依赖于氧的需求。Kurokawa证实当葡萄糖浓度控制在1.1-5.5mM 之间时，不影响杂交瘤细胞的生长，而且葡萄糖消耗及乳酸生成会减少。（20）因此可以通过降低葡萄糖的浓度来控制乳酸的积累。
    1968年Eagle报道，使用半乳糖替代葡萄糖可以减少乳酸产生，随后Imantura报道果糖也能替代葡萄糖减少乳酸产生。Barngrover比较了半乳糖和果糖培养细胞的效果，试验显示细胞培养密度差别不大。（21）Altamirano采用转瓶培养CHO细胞，研究了果糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖的代谢。试验表明葡萄糖和甘露糖的消耗最多，产生的乳酸也多，细胞生长的速度快；半乳糖和果糖的消耗相对较少，乳酸产生的也少，但细胞生长的较慢。葡萄糖与果糖比较，糖消耗量高两倍，乳酸产生两高15倍，细胞密度高1倍。（22）因此也可以使用果糖或半乳糖来降低乳酸的产生量。
    谷氨酰胺并不是必不可少的，Hela细胞可以在不含谷氨酰胺的合成培养基中生长，Vero细胞可以在以10mM果糖替代半乳糖且不含谷氨酰胺的L15培养基中生长。Vriezen认为培养过程中应控制谷氨酰胺的浓度在1-5mM之间。（23）
    1990年Krurano报道使用天冬酰胺替代谷氨酰胺可以减少氨的产生，提高CHO细胞的生长速度。（24）Altamiruno报道以谷氨酸替代谷氨酰胺培养CHO细胞能使氨浓度降低4—5倍，细胞密度增加80%。（22）但是不同的细胞代谢机制不同，缺乏谷氨酰胺合成酶的细胞便不能利用谷氨酸来合成谷氨酰胺。
   
    利用微载体培养细胞能提高细胞的培养密度，使用灌流培养工艺可以使细胞培养密度达到107cells/ml，但是这与悬浮培养杂交瘤细胞的最高培养密度还相差一个数量级。目前微载体的悬浮培养和填充床式培养都还存在一些问题，如果能很好的解决微载体悬浮培养中的细胞物理损伤，以及填充床培养中的传质和扩大培养问题，并对培养过程采用微机在线自动调控，细胞培养密度将会大大提高。

参考文献：
1. Van Wezel . Nature，1976，216：64.
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