[转移贴]-如何表达HA蛋白

rojjer

原帖由圣斗士 发表于29/8/2012 21:49
无法表达流感HA蛋白，百思不得其解，恳请各位大师指点。
看文献上很多是用pCAGGS载体表达的，使用了新买的pCAGGS载体（以前没用过这个载体），将HA的ORF插入了该载体的启动子下游。用293T细胞瞬时转染48h后检测蛋白表达情况。但是western blot 检测不到蛋白条带，同时做的作为阳性对照的样品（病毒感染的293T细胞）能够检测到HA。不知哪位大师用过这个载体表达过流感病毒蛋白，不知道在克隆构建的时候是否还有什么重要序列要加入
十分十分感激！

rojjer

xiangchou812 :
这要看你的转染效率高不高了，如果转染效率低的话可能也不太容易检测得到。另外，你插入的ORF是不是与表达载体中的读码框相吻合？

zzx219:
看看是否易位了？

叶落无声:
估计可能与转染效率以及蛋白在细胞内的表达情况有关吧，因为293T细胞本来转染效率就较高。


圣斗士:
感谢各位大侠啊。我之前查过读码框了，我的ORF的ATG是启动子下游第一个ATG，是不是不会易位啊。我们一直用的293T细胞转染效率很高，而且以前也做过很多克隆，都表达的很好。就这个HA的表达质粒怎么做都做不出来。都已经换过三个表达载体了，后来看文献上都用的这个，结果western blot 还是没能检到

各位大侠有谁用过pCAGGS这个载体吗？在构建克隆时有什么特别要注意的地方吗？

红灯笼：
你也在表达HA蛋白？我们实验室也有做的，表达量很小，是不是跟蛋白性质有关？

圣斗士：
会幸会，表达量低应该是和这个蛋白本身有关吧。你们也是用pCAGGS表达的HA蛋白吗？